【摘 要】
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目的子宫内膜容受性的破坏是子宫内膜异位症引起不孕的主要原因,也是限制辅助生殖技术成功的重要因素。肽基精氨酸脱亚胺酶4（peptidyl arginine deiminase4,PAD4）在胚胎发育、免疫、炎症、肿瘤发生等过程发挥多种生物学功能。PAD4在胚胎着床和蜕膜化过程中的作用至今未有研究报道,探究PAD4在人和小鼠子宫内膜组织中的表达以及其在子宫内膜接受态和蜕膜化中的作用,将为辅助生殖技术提
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目的子宫内膜容受性的破坏是子宫内膜异位症引起不孕的主要原因,也是限制辅助生殖技术成功的重要因素。肽基精氨酸脱亚胺酶4（peptidyl arginine deiminase4,PAD4）在胚胎发育、免疫、炎症、肿瘤发生等过程发挥多种生物学功能。PAD4在胚胎着床和蜕膜化过程中的作用至今未有研究报道,探究PAD4在人和小鼠子宫内膜组织中的表达以及其在子宫内膜接受态和蜕膜化中的作用,将为辅助生殖技术提供理论依据。方法本课题主要建立CD1小鼠早孕模型、假妊娠模型、类固醇激素处理模型和体外诱导基质细胞蜕膜化模型以及应用人的子宫内膜模型,通过检测PAD4蛋白和PAD4 mRNA在人和小鼠子宫内膜中的表达,进而探讨PAD4在胚胎着床及蜕膜化过程中的表达。结果应用免疫荧光检测PAD4蛋白在人子宫内膜基质细胞蜕膜化模型中的表达。PAD4蛋白在蜕膜化细胞的胞质和胞核都有表达,随着蜕膜化的进行,PAD4蛋白在0h、48h、96h的胞质中表达量增加,在144h胞质的表达量减少;PAD4蛋白随着蜕膜化的进行,在胞核的表达量减少。应用免疫组化检测PAD4在人正常和内异症子宫内膜组织中的表达,可见PAD4蛋白在正常子宫内膜组织分泌中期上皮表达较强,在内异症的上皮表达较弱。在正常子宫组织分泌中期及内异症基质细胞表达较强;在正常内膜组织晚期基质细胞表达较弱。在siRNA敲低实验中,PAD4敲低之后,可见PAD4 mRNA的表达量减低,在蜕膜化处理后,IGFBP1 mRNA和PRL mRNA的表达量增加。与正常蜕膜化组相比较,PAD4敲低组PRL mRNA表达量明显降低。在内异症组子宫内膜PAD4敲低之后,可见内异症子宫内膜PAD4 mRNA的表达量减低。在蜕膜化处理后内异症组子宫内膜IGFBP1 mRNA和PRL mRNA的表达量增加,与正常组相比较,内异症子宫内膜PAD4敲低组PRL mRNA和IGFBP1 mRNA表达量明显降低。使用Real-time PCR技术方法,检测小鼠早期妊娠模型中PAD4 mRNA的表达。PAD4 mRNA从妊娠第0.5天（D0.5）到妊娠第1.5天（D4.5）呈现上升的趋势,D2.5胚胎着床以后,PAD4 mRNA的表达随妊娠进展逐渐下降。在D4.5和D5.5天,与着床位点相比,非着床位点表达量下降。为研究PAD4的表达是否与胚胎的存在有关,故采用了假孕模型检测小鼠子宫中PAD4 mRNA的表达。从PD0.5天到PD5.5天,随着妊娠进展,PAD4 mRNA的表达下降。采用雌孕激素调节模型来检测雌孕激素调节对于小鼠子宫组织PAD4 mRNA表达的影响。Real-time PCR显示,P4处理小鼠6h后PAD4 mRNA的表达较未用P4处理组下降;单独E2处理卵巢切除小鼠6h后PAD4 mRNA表达明显降低;雌激素联合孕酮处理后表达量下降。通过雌孕激素联合抑制剂处理卵巢切除的雌鼠观察雌孕激素对PAD4 mRNA表达的调节。与对照组相比,在单独P4处理小鼠6h后PAD4mRNA的表达较对照组表达增强,在P4联合RU489处理卵巢切除小鼠6h后,PAD4 mRNA的表达下降。以皮下注射芝麻油6h为对照,在E2单独处理6h后PAD4 mRNA的表达较对照组下降;E2联合ICI处理6h后PAD4 mRNA的表达较未加ICI处理组下降。通过使用Real-time PCR检测技术检测PAD4 mRNA在使用雌孕激素诱导的小鼠基质细胞蜕膜化过程中的表达,PAD4 mRNA的表达在雌孕激素诱导的蜕膜化后的48h、72h、96h和120h表达升高,24h的细胞中表达下降。结论敲低PAD4基因可以降低PAD4在蜕膜化过程中的表达,表明PAD4参与了蜕膜化过程且对蜕膜化的影响具有剂量依赖性;敲低PAD4基因可以降低PAD4在内异症子宫内膜蜕膜化中的表达,表明PAD4参与了内异症的蜕膜化过程且对蜕膜化的影响具有剂量依赖性;雌、孕激素主要通过雌孕激素受体下调PAD4的表达;PAD4的存在与小鼠胚胎着床有关,且对小鼠子宫中的作用与胚胎的存在有关;PAD4参与了小鼠体外基质细胞蜕膜化过程。
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