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目的:头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)主要起源于上呼吸道和上消化道黏膜,主要累及口腔、咽和喉等部位,占头颈部癌症90%以上,是头颈部癌中最常见的一种严重威胁人类生命健康的恶性表皮来源性肿瘤,虽然近些年随着治疗方法的不断改善,但目前HNSCC患者5年的生存率仅仅保持在50-60%。miRNAs是一类长度约为20-24个核苷酸的内源性小分子非编码RNA,它通过与靶基因mRNA 3′UTR上的互补碱基相结合来抑制靶基因的表达,从而参与调节许多生理活动。目前,越来越多的证据表明,miRNA不仅参与动植物的生长发育,而且miRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展以及转移有密切的关系。近期研究发现hsa-let-7e-5p在很多恶性肿瘤中异常表达,但其对头颈鳞癌发生发展的作用尚无文献报道。近些年研究发现趋化因子受体7(C-C motif chemokine receptor 7,CCR7)不仅在免疫细胞上大量表达,而且在多种肿瘤细胞上的表达也不同程度的升高,并且与人类肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及不良预后等关系密切。我们课题组通过前期实验发现CCR7可以通过多条信号传导通路促进头颈鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。但其上游的调控机制尚不清楚。因此,本论文的主要研究目的是探讨hsa-let-7e-5p在头颈鳞癌中的作用以及CCR7是否参与了hsa-let-7e-5p对头颈鳞癌的调节。方法:我们首先采用实时荧光定量PCR的方法检测hsa-let-7e-5p在头颈鳞癌PCI-37B细胞和PCI-37A细胞中的表达水平(PCI-37B来自于于头颈鳞癌患者的淋巴结转移灶,高表达CCR7,具有较强的迁移和侵袭能力;PCI-37A来自同一患者的原发灶,低表达CCR7,具有较弱的迁移和侵袭能力,该细胞株由匹兹堡大学癌症研究所惠赠)以及检测hsa-let-7e-5p在15对头颈鳞癌患者原发肿瘤组织及其配对的癌旁正常组织中的表达水平。随后采用瞬时转染技术,利用脂质体2000将hsa-let-7e-5p过表达质粒(mimic)和抑制剂片段(inhibitor)分别转染头颈鳞癌PCI-37B细胞和PCI-37A细胞。实验根据头颈鳞癌细胞转移能力的高低分为两大组,每大组再分为三小组,分别为:Blank组(正常PCI-37B未转染),NC组(PCI-37B+NC),Mimic组(PCI-37B+hsa-let-7e-5p mimic);Blank组(正常PCI-37A未转染),NC组(PCI-37A+NC),Inhibitor组(PCI-37A+hsa-let-7e-5p inhibitor)。转染后,通过增殖实验观察头颈鳞癌PCI-37B细胞和PCI-37A细胞的变化;通过划痕及transwell迁移实验观察头颈鳞癌PCI-37B细胞和PCI-37A细胞迁移能力的变化;通过transwell侵袭实验观察头颈鳞癌PCI-37B细胞和PCI-37A细胞侵袭能力的变化;通过生物信息学靶基因预测软件Targetscan、Miranda、Pic Tar预测hsa-let-7e-5p的下游靶基因并通过western blot实验和荧光素酶实验加以验证hsa-let-7e-5p与预测靶基因的关系。最后,通过体内实验观察hsa-let-7e-5p对异种移植肿瘤生长的影响。结果:Hsa-let-7e-5p在头颈鳞癌PCI-37B细胞中相对低表达,在PCI-37A细胞中相对高表达(P<0.01);在15对头颈鳞癌患者原发肿瘤组织及其配对的癌旁正常组织中,hsa-let-7e-5p的表达水平在10/15头颈鳞癌组织中比他们配对的癌旁正常组织显著降低(P<0.01);然而,hsa-let-7e-5p的表达水平在4/15头颈鳞癌组织中比他们配对的癌旁正常组织表达水平显著升高(P<0.01);1例患者头颈鳞癌组织和配对的癌旁正常组织之间hsa-let-7e-5p的表达水平没有显著性差异(P>0.05)。这些数据表明,hsa-let-7e-5p水平的变化可能与HNSCC有关。在研究hsa-let-7e-5p对头颈鳞癌细胞株的增殖实验中,分别于不同时间段(0h,24h,48h,72h,96h)使用CCK8测定转染后的各组细胞在450nm处的OD值并进行相关的统计分析。头颈鳞癌PCI-37B细胞和PCI-37A细胞各组间两两比较。结果显示,0h时各组OD值基本一致。对于PCI-37B各组细胞,过表达hsa-let-7e-5p后,Mimic组在24h、48h、72h和96h的OD值比Blank组及NC组显著降低,P<0.01,差异具有统计学意义。相反,对于PCI-37A各组细胞,抑制hsa-let-7e-5p的表达后,Inhibitor组在24h、48h、72h和96h的OD值比Blank组及NC组显著升高,P<0.01,差异具有统计学意义;NC组和Blank组之间无显著性差异(P>0.05)。说明过表达hsa-let-7e-5p的表达水平后,可以显著抑制头颈鳞癌PCI-37B细胞的增殖;相反,抑制hsa-let-7e-5p的表达水平后,可以显著促进头颈鳞癌PCI-37A细胞的增殖。这些结果说明hsa-let-7e-5p对头颈鳞癌细胞的增殖具有抑制性的作用。针对hsa-let-7e-5p对头颈鳞癌细胞株迁移的作用,我们分别采用了划痕实验及transwell迁移实验进行研究。划痕实验结果显示,0h时各组划痕宽度基本一致;过表达hsa-let-7e-5p后,无论是12h还是24h,Mimic组头颈鳞癌PCI-37B细胞的迁移率都显著低于Blank组及NC组,P<0.01,差异具有统计学意义;相反,抑制hsa-let-7e-5p后,无论是12h还是24h,Inhibitor组头颈鳞癌PCI-37A细胞的迁移率都显著高于Blank及NC组,P<0.01,差异具有统计学意义;NC组和Blank组之间无显著性差异(P>0.05)。与划痕实验结果相似,在transwell迁移实验中,结果显示,过表达hsa-let-7e-5p后,Mimic组头颈鳞癌PCI-37B细胞迁移的数量显著小于Blank组及NC组细胞迁移的数量,P<0.01,差异具有统计学意义;相反,抑制hsa-let-7e-5p后,Inhibitor组头颈鳞癌PCI-37A细胞迁移的数量显著大于Blank组及NC组细胞迁移的数量,P<0.01,差异具有统计学意义;NC组和Blank组之间无显著性差异(P>0.05)。以上结果说明过表达hsa-let-7e-5p的表达水平后,可以显著抑制头颈鳞癌PCI-37B细胞的迁移能力;相反,抑制hsa-let-7e-5p的表达水平后,可以显著提高头颈鳞癌PCI-37A细胞的迁移能力。这些结果说明hsa-let-7e-5p对头颈鳞癌细胞的迁移能力具有抑制性的作用。在研究hsa-let-7e-5p对头颈鳞癌细胞株的中侵袭实验中,结果显示,过表达hsa-let-7e-5p后,Mimic组头颈鳞癌PCI-37B细胞穿过Matrigel胶的细胞侵袭数量显著小于Blank组及NC组穿过细胞的数量,P<0.01,差异具有统计学意义;相反,抑制hsa-let-7e-5p后,Inhibitor组头颈鳞癌PCI-37A细胞穿过Matrigel胶的细胞侵袭数量显著大于Blank组及NC组穿过细胞的数量,P<0.01,差异具有统计学意义;NC组和Blank组之间无显著性差异(P>0.05)。说明过表达hsa-let-7e-5p的表达水平后,可以显著抑制头颈鳞癌PCI-37B细胞的侵袭能力;相反,抑制hsa-let-7e-5p的表达水平后,可以显著提高头颈鳞癌PCI-37A细胞的侵袭能力。这些结果说明hsa-let-7e-5p对头颈鳞癌细胞的侵袭能力具有抑制性的作用。生物信息学的预测结果显示:HMGA2、CCND1、STAT3、LIN28、WNT1、CCR7等都可能是hsa-let-7e-5p的下游靶基因。因为我们课题组先前的研究已经证明,CCR7及其下游信号通路的分子可以促进头颈鳞癌的存活、趋化、迁移和侵袭,所以我们确定将CCR7作为hsa-let-7e-5p的下游靶基因进行后续的实验加以验证。随后的Western Blot实验结果显示,过表达hsa-let-7e-5p后,Mimic组头颈鳞癌PCI-37B细胞中的CCR7的表达水平比Blank组及NC组显著降低,P<0.01,差异具有统计学意义;相反,抑制hsa-let-7e-5p后,Inhibitor组头颈鳞癌PCI-37A细胞中CCR7的表达水平比比Blank组及NC组显著升高,P<0.01,差异具有统计学意义;NC组和Blank组之间无显著性差异(P>0.05)。说明CCR7的表达与hsa-let-7e-5p的表达呈负相关。进一步通过荧光素酶实验证实,头颈鳞癌PCI-37B细胞共转染hsa-let-7e-5p mimic和野生型CCR7 3′UTR质粒实验组中的荧光素酶活性比其它组的荧光素酶活性显著降低,P<0.01,差异具有统计学意义;其它组组间的荧光素酶活性相比无显著性差异(P>0.05),这些结果说明在头颈鳞癌PCI-37B细胞中,CCR7是hsa-let-7e-5p的下游靶基因,hsa-let-7e-5p直接打靶CCR7 3′UTR。体内实验结果显示,过表达hsa-let-7e-5p的表达水平后,第15天时,Mimic组肿瘤的体积显著小于NC组,P<0.05,差异具有统计学意义;第18天时,Mimic组肿瘤的体积显著小于Blank组,P<0.01,差异具有统计学意义;第21天时,Mimic组肿瘤的体积显著小于NC组,P<0.05及小于Blank组,P<0.01,差异具有统计学意义。体内实验结果说明过异位过表达hsa-let-7e-5p抑制了异种移植肿瘤的生长。结论:1、Hsa-let-7e-5p在头颈鳞癌细胞PCI-37B中相对低表达,在PCI-37A中相对高表达。2、Hsa-let-7e-5p在头颈鳞癌患者原发肿瘤组织中低表达。3、Hsa-let-7e-5p抑制了头颈鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭部分通过负向调控下游靶基因CCR7。4、在体内实验中,异位过表达hsa-let-7e-5p抑制了异种移植肿瘤的生长。