目的:乳腺癌是一种发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤,是女性最常见的肿瘤之一,严重威胁着全球女性的健康。其中,雌激素受体阳性（ER阳性）患者占多数。随着内分泌治疗的研究和应用,雌激素受体阳性乳腺癌有了更好的治疗前景。他莫昔芬目前是ER阳性乳腺癌患者内分泌治疗的一线药物。他莫昔芬是一种雌二醇竞争性拮抗剂,除了能与乳腺细胞的雌激素受体结合,它还可以通过阻断细胞对谷氨酰胺的摄入抑制乳腺癌细胞的增殖。但是患者极易发展形成获得性耐药。因此,更好地了解他莫昔芬耐药性产生的分子机制,对克服他莫昔芬耐药性的产生及进一步改进乳腺癌的治疗方案具有重要意义。SIRT4是一种线粒体蛋白,为高度保守的Sirtuins蛋白家族的成员。现已有大量文献证明SIRT4在人类大多数癌症,包括乳腺癌中作为抑癌基因发挥作用。但关于SIRT4在癌症中发挥作用的分子机制的研究尚不成熟。SIRT4具有ADP-核糖基转移酶活性,通过与谷氨酸脱氢酶结合,将谷氨酸脱氢酶转化为ADP-核糖基酶,阻碍谷氨酸转变为α-酮戊二酸进入三羧酸循环,从而抑制谷氨酰胺代谢。众所周知,肿瘤细胞的生长过程中需要大量营养物质的不断供应。谷氨酰胺是细胞存活的重要能量来源及氮元素来源,是细胞生长的必需营养素,它在恶性肿瘤的发生发展中扮演重要角色。谷氨酰胺除了为肿瘤细胞中生物大分子的合成提供物质基础外,它还参与细胞内多条信号传导通路的调节。鉴于SIRT4对细胞中谷氨酰胺代谢的抑制作用,我们首次提出SIRT4可能与ER阳性乳腺癌对他莫昔芬的敏感性有关。有研究人员证实了谷氨酰胺通过调控STAT3活性调节癌细胞的侵袭性,它的缺失显著降低了高侵袭性卵巢癌细胞中STAT3酪氨酸第705位点（Y705）的磷酸化水平。在结肠癌细胞中,谷氨酰胺的缺失阻遏了MYC的翻译过程,重新加入谷氨酰胺该过程又可恢复。STAT3是多种生长因子或细胞因子信号通路激活的关键点,STAT3通路的激活可以诱导肿瘤细胞的增殖,而其抑制可以促进肿瘤细胞的凋亡。多种细胞因子,如IL-6,可以通过细胞膜上相应的酪氨酸激酶相关受体来激活STAT3信号通路完成信号传导。在大多数人类癌症中可见通过酪氨酸第705位点磷酸化实现的STAT3过度激活。而且,已有研究人员证明,在他莫昔芬耐药的MCF7（MCF7/TAM）细胞中STAT3酪氨酸第705位点磷酸化水平升高。MYC和CCND1是STAT3信号通路的靶基因。有文献指出,在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞系MCF7/TAM中,MYC基因的表达显著上调,敲除MYC基因后,细胞对他莫昔芬更敏感。CCND1基因扩增的ER阳性肿瘤对他莫昔芬不敏感。虽然,已有研究证明敲除SIRT4可以降低大肠癌细胞对5-FU化疗敏感性,但是SIRT4是否影响乳腺癌对他莫昔芬的敏感性并不确定,而且SIRT4影响药物敏感性的机制也尚不明确。我们的研究旨在探究SIRT4蛋白及mRNA在乳腺癌对他莫昔芬敏感性中的作用及其潜在的分子生物学机制,为今后乳腺癌内分泌治疗耐药的研究提供基础。研究方法:1.乳腺癌细胞系MCF7和T47D购买自中科院上海细胞库,并按照其官方网站公布的培养配方进行培养。MCF7细胞的培养使用添加10%胎牛血清的DMEM培养基,T47D细胞的培养使用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。所有细胞均用有滤孔的无菌培养瓶,在37℃5%CO2孵箱中培养。每2天用0.25%胰蛋白酶消化传代一次。将重悬的细胞均匀地铺在6孔细胞培养板中,利用Lipofectamine 3000向细胞内转入SIRT4质粒或SIRT4特异性干扰序列,以达到上调或下调SIRT4表达的目的,为后续实验提供基础。细胞在48-72小时后可以使用。2.用人谷氨酰胺酶联免疫吸附测定试剂盒检测培养基中谷氨酰胺的含量。准备所需的微孔酶标板,设置标准品孔和样本孔。在每个标准品孔中加入50μL标准液。在每个样本孔中加入10μL待测样本和40μL样本稀释剂。向每孔中加入100μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体后,用封板膜覆盖,37°C孵育60分钟。弃去液体并清洗,此过程再重复4次。在吸水纸上拍干。每孔加入50μL底物A和50μL底物B,轻轻混匀,37°C避光孵育15分钟。向每孔中依次加入50μL终止液,在15分钟内读取450 nm处的吸光度。3.将6孔细胞培养板中的MCF7和T47D细胞分别进行细胞计数,然后在96孔细胞培养板中接种100μL细胞悬液（50000个细胞/mL）,将培养板放在培养箱中培养（37℃,5%CO2）。12小时后,更换为含有不同浓度他莫昔芬（1μM,2μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM,40μM,80μM）的培养基,继续培养48小时。之后,每孔加入10μL CCK-8溶液,继续在培养箱内孵育1小时。用酶标仪测定450nm处的吸光度。计算IC50值并绘制IC50曲线。4.将6孔细胞培养板中的MCF7和T47D细胞分别进行细胞计数。取5个96孔细胞培养板,以每孔相同数量的细胞接种到板中,放入CO2孵箱培养。每天取出1板,连续5天定时加入CCK-8,使用酶标仪检测450nm处每孔的吸光度,根据读数绘制细胞增殖曲线。5.在24孔细胞培养板中放入细胞爬片,将6孔细胞培养板中的MCF7和T47D细胞分别均匀铺于爬片之上。待细胞贴壁后,使用PBS清洗3次,用4%多聚甲醛固定10分钟。用0.5%Triton X-100（用PBS配制）打孔。滴加山羊血清于室温封闭1小时。在每张爬片上滴加20μL STAT3抗体,并放入湿盒,4℃孵育过夜。第二天用山羊抗鼠荧光二抗于室温孵育2小时。用DAPI染核后,用抗荧光淬灭封片液封片,然后在荧光显微镜下观察细胞中STAT3的定位并采集图像。6.6孔细胞培养板中的细胞经0.25%胰蛋白酶消化后分别收集于管中。然后在4°C条件下,将悬浮液以1000转/分的速度离心10分钟。去除上清液后,向每个管中添加1mL PBS,使细胞悬浮之后再次离心。该步骤再重复2次。在每管中加入500μL Binding Buffer,使细胞悬浮其中,随后依次加入10μL Annexin V-FITC和10μL PI混匀。此过程注意避光。15分钟后,使用流式细胞仪检测不同处理组细胞的凋亡率。7.收集6孔细胞培养板中的细胞,使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液NP40对其进行裂解。注意冰上操作。从细胞裂解液中提取蛋白质,并用Bradford法对其进行定量。用SDS-PAGE法分离不同分子量的蛋白质,并将其转印到用甲醇活化的PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭2小时。之后在4°C条件下,用抗体孵育过夜。第二天,用过氧化物酶偶联抗鼠或抗兔IgG在37℃条件下孵育2小时。用ECL检测蛋白质水平。8.在6孔板的每孔中加入1m L TRIZOL,将细胞收集到管中。加入200μl三氯甲烷,吸取上清至新管。加入500μL异丙醇,弃上清。用乙醇纯化沉淀。该沉淀即为细胞的总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,采用实时定量PCR法对各组RNA水平进行定量分析。实验条件为:50℃2 min,95℃10 min,95℃15 s 40个循环,60℃1 min。选择GAPDH作为内参基因对目的基因的表达进行标准化。引物序列如下:SIRT4 Forward primer 5′–ACCCTGAGAAGGTCAAAGAGTTAC–3′;SIRT4 Reverse primer 5′–TTCCCCACAATCCAAGCAC–3′;MYC Forward primer 5′–TGAGGAGGAACAAGAAGATG–3′;MYC Reverse primer 5′–ATCCAGACTCTGACCTTTTG–3′;CCND1 Forward primer 5′–GCTGCGAAGTGGAAACCATC–3′;CCND1 Reverse primer 5′–CCTCCTTCTGCACACATTTGAA–3′;GAPDH Forward primer 5′–GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT–3′;GAPDH Reverse primer 5′–GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG–3′.9.采用SPSS进行统计学分析。所有数据均表示为平均值±标准偏差。通过t检验评估两组之间的差异。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,P<0.05即被认为具有统计学意义。结果:1.与仅用他莫昔芬处理的MCF7和T47D细胞相比,同时转染SIRT4的细胞摄入更少的谷氨酰胺。2.与只用他莫昔芬处理的MCF7和T47D细胞相比,同时转染SIRT4的细胞相对活力更弱,增殖能力更弱,凋亡率更高,他莫昔芬对细胞的IC50减小;同时下调SIRT4的细胞相对活力增强,增殖能力增强,凋亡率降低,他莫昔芬对细胞的IC50增大。3.转染SIRT4后STAT3（Y705）的磷酸化水平降低,入核减少,干扰SIRT4后STAT3（Y705）的磷酸化水平升高,入核增加。4.上调SIRT4对STAT3信号通路的抑制作用被IL-6逆转,下调SIRT4对STAT3信号通路的促进作用被S3I-201逆转。5.转染SIRT4后,STAT3信号通路靶基因MYC、CCND1的蛋白和mRNA表达水平均降低,干扰SIRT4后,其表达水平升高。6.共同转染或干扰SIRT4和STAT3后,STAT3逆转了SIRT4上调或下调对细胞相对活力的影响。7.与对照组相比,转染SIRT4组IL-6蛋白表达水平明显较低,干扰SIRT4组IL-6蛋白表达水平明显升高。结论:1.SIRT4增强他莫昔芬对ER阳性乳腺癌细胞谷氨酰胺摄入的抑制作用。2.SIRT4增强ER阳性乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。3.SIRT4抑制STAT3通路激活及其靶基因表达。4.SIRT4通过STAT3通路增强ER阳性乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。5.SIRT4通过下调IL-6抑制STAT3通路激活。