糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)在生物进化中是十分保守的基础核转录因子，对维持生命活动至关重要，特别是在调节机体生理功能及在创伤或疾病发生、发展过程中起重要作用，已有实验证实敲除GR基因的小鼠是无法存活的，说明GR是介导多种重要生理功能的基础蛋白。 本所前期研究工作证实GR在早期严重烫伤和烧伤后：多种组织器官的GR含量减少，GR表观结合容量也相应降低；尤其是GR核转位减少导致GR的转录激活能力减弱；同时参与全身性炎症反应的细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等浓度显著升高，GR减少与高细胞因子血症之间互为因果，呈级联放大效应。分析认为GR减少是体内抗炎症机制减弱的主要原因，与全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的发生密切相关。根据GR变化特点，针对性地调节GR的表达和功能状态，有望减轻或防止过度炎症反应和继发性全身损害的发生。因此，本课题组以人糖皮质激素受体配体结合区(glucocorticoid receptor-ligand binding domain, GR-LBD)为诱饵，采用酵母双杂交方法从人骨髓cDNA文库筛选到5个与GR-LBD相互作用的候选蛋白，其中采用GST沉淀实验(GST Pull Down)、免疫共沉淀(Co-IP)，证实了干扰素诱导蛋白P56能与GR-LBD在体内、外发生相互作用，且可以配体非依赖方式与GR结合，抑制GR介导的转录活性，是GR的辅阻遏子。即当机体处于过度炎症反应和继发性全身损害后，P56合成增加，增加的P56与GR-LBD结合，致使GR的含量减少，活性减弱，使机体处于高细胞因子状态，导致过度炎症反应发生。 干扰素(interferon，IFN)诱导蛋白P56是上世纪七十年代发现的。P56与GR的相互作用文献报道未见，更不知其功能意义。为了寻求能与GR-LBD结合的更小的P56片段，针对该片段对GR进行调控，减轻过度炎症反应的发生，本研究在以往的工作基础上采用酵母双杂交技术对P56与GR-LBD相互作用的结构域进行了全面分析，找到了GR与P56相互作用的特定结构域，同时构建了P56的表达载体，进行了初步的诱导表达，其主要结果如下： 一、成功构建P56缺失突变体片段酵母表达质粒第三军医大学硕士学位论文 用IFN诱导HTIOSO细胞，提取mRNA、反转录形成cDNA，设计不同的引物，PCR扩增获得P56全长及一系列缺失突变体，与T.、乞以优连接、转化，挑取阳性克隆，酶切鉴定，P56全长和一系列缺失突变片段分别装入酵母表达载体pGADT7，测序，证实所有序列与设计序列完全一致。 二、确定P56蛋白与GR结合的特定结构域 采用酵母双杂交技术，将构建的P56全长及一系列缺失突变体片段重组质粒与pGBKT7一GRLBD质粒两两配对共转化入酵母中，选择三缺培养基SD/- His一LeuJ帅培养(即培养基中无组氨酸、亮氨酸、色氨酸，便于选择带有相应营养素基因的转化株及筛选基因的功能)，ONPG法检测p一gal活性以判定每一个P56缺失突变体与GR.LBD结合力的大小，确定P56蛋白与GR一LBD相互作用的能力，其结果显示P56与GR相互作用的特定结构域在P56的600~957位碱基，即179~2%氨基酸区域(氨基酸位点从第64位碱基算起，而开放阅读框是从第65位碱基开始)。 三、P56蛋白全长重组诱导表达 P56蛋白全长DNA序列插入pGEx一T-1表达载体中，转化BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，IPTG诱导，取菌液，超声破碎裂解包涵体，SDS一队GE鉴定，在IPTG浓度为0.lmM。比，诱导时间为3、4.5、5.5、6.5、7，5小时可诱导表达出P56蛋白。