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目的:
本研究将通过分别检测野生型C57BL/6小鼠和LysMcreRosa26flox/flox小鼠(巨噬细胞特异性表达红色荧光),形觉剥夺诱导不同时间点巩膜巨噬细胞密度及表达MMP-2的情况,以明确巨噬细胞及其表达MMP-2的功能与近视形成的相关性;其次,检测小鼠腹腔注射PLX溶液以消除巩膜巨噬细胞对形觉剥夺性近视(FDM)发生发展的作用,以明确巨噬细胞是否参与近视形成;最后,通过体外细胞实验探究缺氧是否是巨噬细胞浸润及其分泌的MMP-2参与近视形成的触发因素。
方法:
1、3周龄雄性野生型C57BL/6小鼠形觉剥夺2周,形觉剥夺结束后检测巩膜巨细胞密度变化及MMP-2的表达情况。
2、3周龄LysMcreRosa26flox/flox小鼠(巨噬细胞特异性表达红色荧光蛋白,tdTomato),分别进行形觉剥夺2天、1周、2周,形觉剥夺结束后检测巩膜巨细胞密度变化。
3、3周龄雄性野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射PLX(Pexidartinib,PLX-3397,一种口服有效的CSF-1R抑制剂)以消除巩膜巨噬细胞,评估其对FDM发生发展的影响。
4、体外实验:对人成纤维细胞(HSFs)进行低氧(1%氧气)处理,检测其Ccl2mRNA表达水平及分泌CCL2蛋白的情况;对小鼠腹腔巨噬细胞进行低氧处理,检测其MMP-2的表达情况,以探究缺氧是否通过调控巨噬细胞的浸润及MMP-2表达功能进而参与近视形成。
结果:
1、免疫荧光结果表明:野生型C57BL/6小鼠形觉剥夺2周,剥夺眼巩膜后极部巨噬细胞密度较对侧眼(P=0.0095)和对照眼(P=0.0195)明显升高;其分泌MMP-2的巨噬细胞功能较对侧眼(P=0.0212)和对照眼(P=0.0449)显著增强。
2、LysMcreRosa26flox/flox小鼠形觉剥夺1周、2周后,形觉剥夺眼巩膜后极部tdTomato荧光蛋白标记的巨噬细胞密度较对侧眼明显增加(1周:P=0.047;2周:P=0.026);形觉剥夺2天时剥夺眼较对侧眼无明显差异。
3、小鼠腹腔注射PLX可显著消除小鼠巩膜组织的巨噬细胞,但对小鼠的屈光发育及形觉剥夺性近视形成无明显影响。
4、对HSFs进行低氧处理后,Ccl2mRNA表达水平及CCL2分泌显著增多;对小鼠腹腔巨噬细胞进行低氧处理后,MMP-2的表达显著升高。
结论:
巩膜缺氧微环境可能通过促进巩膜成纤维细胞分泌CCL2,诱导单核细胞浸润至巩膜组织,并分化为高表达MMP-2的巨噬细胞参与近视形成。
本研究将通过分别检测野生型C57BL/6小鼠和LysMcreRosa26flox/flox小鼠(巨噬细胞特异性表达红色荧光),形觉剥夺诱导不同时间点巩膜巨噬细胞密度及表达MMP-2的情况,以明确巨噬细胞及其表达MMP-2的功能与近视形成的相关性;其次,检测小鼠腹腔注射PLX溶液以消除巩膜巨噬细胞对形觉剥夺性近视(FDM)发生发展的作用,以明确巨噬细胞是否参与近视形成;最后,通过体外细胞实验探究缺氧是否是巨噬细胞浸润及其分泌的MMP-2参与近视形成的触发因素。
方法:
1、3周龄雄性野生型C57BL/6小鼠形觉剥夺2周,形觉剥夺结束后检测巩膜巨细胞密度变化及MMP-2的表达情况。
2、3周龄LysMcreRosa26flox/flox小鼠(巨噬细胞特异性表达红色荧光蛋白,tdTomato),分别进行形觉剥夺2天、1周、2周,形觉剥夺结束后检测巩膜巨细胞密度变化。
3、3周龄雄性野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射PLX(Pexidartinib,PLX-3397,一种口服有效的CSF-1R抑制剂)以消除巩膜巨噬细胞,评估其对FDM发生发展的影响。
4、体外实验:对人成纤维细胞(HSFs)进行低氧(1%氧气)处理,检测其Ccl2mRNA表达水平及分泌CCL2蛋白的情况;对小鼠腹腔巨噬细胞进行低氧处理,检测其MMP-2的表达情况,以探究缺氧是否通过调控巨噬细胞的浸润及MMP-2表达功能进而参与近视形成。
结果:
1、免疫荧光结果表明:野生型C57BL/6小鼠形觉剥夺2周,剥夺眼巩膜后极部巨噬细胞密度较对侧眼(P=0.0095)和对照眼(P=0.0195)明显升高;其分泌MMP-2的巨噬细胞功能较对侧眼(P=0.0212)和对照眼(P=0.0449)显著增强。
2、LysMcreRosa26flox/flox小鼠形觉剥夺1周、2周后,形觉剥夺眼巩膜后极部tdTomato荧光蛋白标记的巨噬细胞密度较对侧眼明显增加(1周:P=0.047;2周:P=0.026);形觉剥夺2天时剥夺眼较对侧眼无明显差异。
3、小鼠腹腔注射PLX可显著消除小鼠巩膜组织的巨噬细胞,但对小鼠的屈光发育及形觉剥夺性近视形成无明显影响。
4、对HSFs进行低氧处理后,Ccl2mRNA表达水平及CCL2分泌显著增多;对小鼠腹腔巨噬细胞进行低氧处理后,MMP-2的表达显著升高。
结论:
巩膜缺氧微环境可能通过促进巩膜成纤维细胞分泌CCL2,诱导单核细胞浸润至巩膜组织,并分化为高表达MMP-2的巨噬细胞参与近视形成。