核桃SSR反应体系的优化及群体遗传多样性分析

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核桃(Juglans regia L.)是中国栽培历史悠久、分布广泛、种质资源极为丰富的古老果树。但是对核桃的起源问题一直争议颇多,对此已经进行了、炭化核桃和古代森林遗迹等方面的考察研究,认为新疆野核桃可能是栽培核桃(J.regia L.)的直接祖先,有待从分子水平上进一步研究确认。本研究在建立和优化核桃SSR反应体系的基础上,首次利用分子系统学的原理采用SSR标记技术对新疆伊犁野核桃、喀什实生核桃及部分栽培品种的遗传结构进行了分析,旨在深入探讨栽培核桃起源演化,并为栽培核桃进一步的品种选育提供分子依据。主要研究结果如下:1.以清香、香铃、爱米格为试材,利用CTAB法提取基因组DNA,将PCR体系的主要成分分别设定5个梯度,根据每个成份的变化引起的PCR-SSR的效果差异,探讨了核桃SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物WGA321的适宜退火温度进行优化。最终确定了引物WGA321的最适宜退火温度范围为46℃和54℃之间,PCR反应体系的最佳条件为:15μL体系中, Mg2+ 1.0 mmol/L,dNTPs浓度0.10~0.20 mmol/ L,TaqE用量为0.5U,DNA模板1.0 ng/μL,引物浓度为0.4μmol/L。利用此反应体系对部分核桃品种进行PCR扩增并电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合核桃的亲缘关系分析。2.利用来自黑核桃的7对SSR引物对新疆伊犁野核桃、喀什实生核桃及部分栽培品种的80份种质材料为试材,进行遗传多样性分析。7对引物平均多态性带比率98.01%,期望杂合度0.1589~0.4359,香农指数0.2734~0.6225,表明各位点的多态性非常丰富。对三个群体的杂合度与香农系数及多态位点百分比进行分析,表明喀什实生核桃的遗传多样性最高(He=0.3085,I=0.4669,P=95.83%) ,与栽培核桃的遗传多样性基本一致(He=0.3050,I=0.4646,P=86.84%) ,伊犁野生核桃的遗传多样性最低(He=0.2325,I=0.3361,P=56.52%)。3.本研究对三个核桃群体遗传结构的参数——遗传分化系数和基因流进行了分析。三个核桃群体的遗传分化系数(Gst)为0.1928,表明三个核桃的遗传变异主要存在群体内,占总变异的80.72%,而群体间的遗传变异仅占总变异的19.28%。根据遗传分化系数Gst间接推测基因流(Nm = 2.0934) ,说明三个核桃群体存在适度的基因交流,而种子的传播或人为实生选种和杂交育种可能是基因交流的主要原因。4.从三个群体中随机选出10个株系或品种根据欧氏平方距离利用平均连锁法,使用SPSS version 10.3进行类型间的聚类分析,所有参试株系或品种相互交叉,说明伊犁野核桃、喀什实生核桃和栽培品种之间存在基因渗透和交流(基因流Nm=2.0934) ;在聚类中的四类中喀什实生核桃和栽培品种比伊犁野核桃混杂的严重,说明喀什实生核桃和栽培品种有更复杂的遗传背景;三个国外品种意大利1号和爱米格及清香与伊犁野核桃及喀什实生核桃的亲缘关系比与其它栽培品种的近。采用内氏遗传距离,UPGMA法聚类分析,栽培品种和喀什实生核桃的亲缘关系最近,遗传距离只有0.0559,其次是与伊犁野生核桃的,遗传距离为0.0938。根据所有的聚类关系,初步提出了伊犁野核桃、喀什实生核桃和栽培品种的亲缘演化关系图。为“我国是世界栽培核桃的起源中心之一”的论断进一步提供了分子证据。
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