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1目的:1本实验通过体外细胞培养技术,建立一种提取培养人脂肪来源干细胞(human adipose derived stem cells,hADSCs)的高效方法,在使细胞大量扩增的同时保持其潜在的分化能力,为下一步实验提供稳定的hADSCs培养体系。2通过研究中药单体川续断皂苷Ⅵ(Asperosaponin Ⅵ,ASD)对h ADSCs增殖及向成骨细胞分化的影响,评价ASD在诱导hADSCs向成骨分化过程中的作用,探索ASD作为一种生长因子应用于骨组织工程的可能性,同时为骨组织工程种子细胞的诱导剂的优化选择提供试验依据。2方法:1应用酶消化加离心方法分离、培养hADSCs,并通过倒置相差显微镜观察细胞形态学特点;酶标仪检测各时段吸光度值并分析细胞生长曲线特点;向成骨细胞、脂肪细胞诱导分化并行茜素红染色、油红O染色,鉴定所获得的细胞为hADSCs,作为后续实验的种子细胞。2把ASD溶解到含10%FBS L-DMEM培养基中,配制成10-4 mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L四个浓度组的细胞培养液,同时用成骨诱导液(即阳性对照组由0.1mol/L的β-甘油磷酸钠、10-8mol/L地塞米松和50mg/L的磷酸化Vc组成)干预hADSCs,用MTT法检测不同浓度ASD及阳性对照组对hADSCs增殖分化的影响。3应用ALP法检测不同浓度ASD对hADSCs成骨分化的影响,确定最佳诱导浓度;同时实验再分空白组、最佳ASD组、阳性对照组和最佳ASD组+阳性对照组,应用ALP检测法和茜素红染色法检验对hADSCs成骨分化的差异,观察ASD诱导hADSCs向成骨方向分化的能力。3结果:1用0.1%I型胶原酶对行抽脂术获得的人脂肪组织液进行消化分离提取培养原代hADSCs,2天后进行首次换液,细胞达到80%融合度进行传代培养。通过绘制细胞生长曲线显示,细胞生长整体呈“S”型,即经历停滞期、对数增长期和平台期。向成骨、成脂方向诱导后行茜素红染色、油红O染色呈阳性,培养的细胞为hADSCs.2不同浓度的ASD及阳性对照组与hADSCs共培养后,MTT检测显示在一定浓度范围内(10-5 mol/L、10-6 mol/L)的ASD可以促进hADSCs增殖,与空白组相比差异具有统计学意义(P<0.05),阳性对照组、浓度为10-4 mol/L和10-7mol/L的ASD与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。阳性对照组不能够促hADSCs增殖。3不同浓度的ASD及阳性对照组与hADSCs共培养1、3、5、7d后行ALP活性检测,浓度为10-6 mol/L、10-5 mol/L的ASD呈阳性,与空白组比较有统计学意义(P<0.05),浓度为10-5 mol/L的ASD与10-6 mol/L相比差异有统计学意义(P<0.05),10-5 mol/L是最佳诱导浓度组。与空白组相比,最佳ASD组、阳性对照组和最佳ASD组+阳性对照组三组在诱导第3、6、9d都能提高ALP的活性(P<0.05),同样时间点最佳ASD组、阳性对照组和最佳ASD组+阳性对照组三组之间相比差异具有统计学意义(P<0.05),最佳ASD组+阳性对照组与最佳ASD组、阳性对照组比较有统计学意义(P<0.05)。第12d各组ALP活性都下降,其中最佳ASD组+阳性对照组与其他三组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。四组细胞诱导2周后,进行茜素红染色,通过染色结果可见空白组染色结果呈阴性,最佳ASD组中可见少量钙化结节。阳性对照组和最佳ASD组+阳性对照组可见明显的红染钙化结节,呈橘红色,最佳ASD组+阳性对照组与阳性对照组相比数量多,面积较大。4结论:1本实验成功从抽脂术获得的人脂肪组织中分离培养出hADSCs,在体外能够稳定传代增殖,且能够向成骨、成脂细胞方向分化。2 ASD在一定浓度范围内可以促进第3代hADSCs在体外增殖并向成骨细胞分化,增加ALP活性,因此ASD可以作为hADSCs向成骨分化的诱导因子。作为细胞生长因子应用于骨组织工程有一定的可行性,为进一步研究ASD提供实验基础。