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第一部分HIF-1α、LC3、E-cadherin和Vimentin在子宫内膜异位症中的表达研究目的研究自噬基因LC3在子宫内膜异位症(内异症)在位和异位子宫内膜中的表达变化及与低氧诱导因子HIF-1α和上皮-间质转化相关标志物E-cadherin和Vimentin的关系。方法收集明确诊断为内异症患者增生期在位子宫内膜组织及异位子宫内膜组织,每组各30例,以单纯输卵管因素不孕妇女增生期子宫内膜组织(31例)为对照。免疫组织化学染色法(IHC)检测LC3、HIF-1α、E-cadherin和Vimentin在各组子宫内膜组织中的定位和表达情况。Western blot检测各组子宫内膜组织LC3、HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的蛋白表达。结果免疫组化结果显示:(1)LC3主要定位于子宫内膜上皮细胞与基质细胞的胞浆部位,卵巢巧克力囊肿组织(内异症异位内膜组织)中LC3的表达较在位子宫内膜和正常子宫内膜明显增高(p<0.05),而内异症在位子宫内膜和正常子宫内膜LC3的表达无显著差异(p>0.05);(2)HIF-1α在子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞的细胞浆和细胞核中均有表达。内异症患者异位子宫内膜HIF-1α的表达较在位子宫内膜和正常子宫内膜明显增高(p<0.05),而内异症在位子宫内膜和正常子宫内膜HIF-1α的表达无显著差异(p>0.05);(3)E-cadherin主要表达于子宫内膜腺上皮细胞胞膜中。内异症患者异位子宫内膜E-cadherin的表达较在位子宫内膜和正常子宫内膜明显降低(p<0.05),而内异症在位子宫内膜和正常子宫内膜E-cadherin的表达无显著差异(p>0.05);(4)Vimentin在子宫内膜上皮细胞与基质细胞的胞浆中均有表达。内异症异位病灶组织中Vimentin的表达较在位子宫内膜和正常子宫内膜明显增高(p<0.05),而内异症在位子宫内膜和正常子宫内膜Vimentin的表达无显著差异(p>0.05)。Western blot结果显示,与正常子宫内膜和内异症在位子宫内膜比较,内异症异位子宫内膜LC3、HIF-1α、Vimentin的表达显著升高,而E-cdherin表达明显降低(p<0.05)。结论内异症患者异位子宫内膜自噬基因LC3的表达明显增高,并与HIF-1α和Vimentin呈正相关,而与E-cadherin呈负相关。提示:低氧可能参与了内异症自噬的发生,而自噬则可能参与了内异症上皮间质转化。第二部分 低氧介导HIF-1α调控自噬促进内异症子宫内膜基质细胞迁移与侵袭的作用机制研究目的1.研究低氧是否通过HIF-1α通路促进内异症子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cell,ESCs)自噬发生。2.研究自噬在低氧介导HIF-1α促进ESCs迁移和侵袭中的作用。方法1.分离、培养及鉴定人原代子宫内膜基质细胞(ESCs)。2.低氧干预ESCs不同时间段,吖靛橙染色和MDC染色检测自噬小体的形成;透射电镜检测ESCs中自噬体的形成;Western blot检测HIF-1α、LC3、Beclin1和P62的表达情况。3.分别将HIF-1α 过表达质粒和 HIF-1α siRN转染ESCs,Western blot 检测 HIF-1α、LC3和Beclin1的表达情况;将GFP-LC3腺病毒转染入ESCs后分别将HIF-1α过表达质粒和HIF-1α siRNA转染ESCs,激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3斑点的聚集情况。4.分别将空载siRNA和HIF-1α siRN转染ESCs后置于常氧和低氧条件下培养,Transwell实验检测细胞的迁移与侵袭能力。5.分别将空载siRNA和Beclin1 siRN转染ESCs后置于常氧和低氧条件下培养,Transwell实验检测细胞的迁移与侵袭能力。6.分别使用自噬抑制剂氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ)和3-甲基腺嘿呤(3-Methyladenine,3-MA)干预ESCs后置于常氧和低氧条件下培养,Transwell实验检测细胞的迁移与侵袭能力。结果1.成功分离人原代子宫内膜基质细胞,细胞纯度和阳性率均高于95%。2.低氧可通过HIF-1α通路促进内异症ESCs自噬发生。3.自噬参与了低氧介导HIF-1α促进内异症ESCs的迁移和侵袭。结论低氧通过HIF-1α激活自噬,促进ESCs的迁移和侵袭参与内异症的发生发展。第三部分 LncRNA MALAT1在低氧介导HIF-1α调控内异症子宫内膜基质细胞自噬中的作用及机制研究目的1.研究LncRNA MALAT1在低氧介导HIF-1α调控内异症子宫内膜基质细胞自噬中的作用。2.研究LncRNAMALAT1介导自噬对内异症子宫内膜基质细胞凋亡的影响。方法1.人原代子宫内膜基质细胞(ESCs)的分离、培养和鉴定(第二部分已完成)。2.RT-PCR检测内异症组织中LncRNAMALAT1表达情况,Western blot检测内异症组织中HIF-1α和LC3蛋白表达情况。3.分别将HIF-1α过表达质粒和HIF-1α siRNA转染ESCs,Western blot检测HIF-1 α 表达,RT-PCR 检测 LncRNA MALAT1 表达。4.分别在常氧和低氧条件下转染空载siRNA(si-NC)和LncRNA MALAT1 siRNA,Western blot检测Beclin1和LC3蛋白表达,GPF-LC3腺病毒转染检测绿色荧光斑点形成情况,透射电镜检测自噬体形成情况。5.分别在常氧和低氧条件下使用3-MA和Beclin1 siRNA阻断自噬,MTT检测细胞存活率,Western blot检测Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡比例,Hoechst33342染色检测细胞核凋亡情况。结果1.与正常内膜和内异症在位内膜相比,内异症异位内膜中LncRNA MALAT1、HIF-1α及LC3表达水平明显升高。2.常氧条件下过表达HIF-1α能够促进LncRNA表达,低氧作用下沉默HIF-1α则抑制LncRNAMALAT1表达。3.低氧条件下沉默LncRNAMALAT1能够抑制低氧诱导的ESCs自噬。4.低氧条件下抑制自噬能够促进ESCs凋亡。结论低氧能够通过HIF-1α信号通路促进LncRNAMALAT1表达,继而激活自噬来促进子宫内膜基质细胞存活。第四部分低氧介导HIF-1α调控自噬诱导上皮-间质转化促进子宫内膜异位症异位病灶形成的机制研究目的1.明确低氧是否诱导内异症子宫内膜上皮细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。2.研究自噬在低氧诱导的内异症子宫内膜上皮细胞EMT中的作用。方法1.低氧条件下培养人原代子宫内膜上皮细胞不同时间段,Western blot检测E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表达,倒置光学显微镜观察细胞形态变化;细胞免疫化学检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达并观察细胞形态变化。2.低氧条件下培养原代子宫内膜上皮细胞不同时间段,Western blot检测HIF-1α、Beclinl和LC3蛋白表达,透射电子显微镜检测细胞自噬体形成。体外培养子宫内膜癌Ishikawa细胞,低氧和常氧刺激后,Western blot检测HIF-1α、Beclin1和LC3蛋白表达,GFP-LC3腺病毒转染后检测绿色荧光斑点形成情况。分别过表达和沉默HIF-1α后,进一步用Western blot检测HIF-1α、Beclin1和LC3蛋白表达。3.常氧和低氧条件下分别使用3-MA、CQ和Beclin1 siRNA来阻断细胞自噬后,Western blot 检测 Beclin1、LC3、E-cadherin 和 Vimentin 表达变化,Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力。结果1.低氧能够诱导子宫内膜上皮细胞EMT发生和促进细胞迁移、侵袭。2.低氧能够通过HIF-1α信号通路诱导子宫内膜上皮细胞自噬发生。3.抑制自噬能够阻断低氧诱导的EMT并削弱细胞迁移、侵袭能力。结论低氧通过HIF-1α信号通路诱导自噬,进而促进子宫内膜上皮细胞EMT和迁移、侵袭。