背景鼻咽癌是东南亚及华南地区常见的高侵袭性的恶性肿瘤,在我国,尤其以广东高发,是严重影响人民健康的恶性肿瘤。目前鼻咽癌的病因及发病机制尚未完全清楚,其发生与遗传、饮食习惯、EB病毒感染及环境等多种因素有关,男性发病风险较女性高,男女发病的性别比约2：1。虽然随着对鼻咽癌的研究深入,目前主要治疗方法是放射治疗或以放射治疗为主的综合治疗,并使大部分鼻咽癌患者获得较好的短期疗效,虽然如今调强放疗方法能够让鼻咽癌患者五年生存率提高到65%-70%左右,但远处转移和局部复发成为治疗失败的主要原因,有文献报道约55%的鼻咽癌病人在治疗后5年出现了复发转移,大量的临床实践表明,鼻咽癌对放疗或化疗抗拒是导致治疗失败主要因素之一。因此,为了提高鼻咽癌患者的五年生存率,必须通过科学的研究以寻找更为有效的治疗技术,而寻找鼻咽癌的特异性肿瘤标志物或信号传导通路可以为靶向药物的研发提供帮助。近年来,肿瘤干细胞(CSC)理论提出并认为,肿瘤复发、转移以及对治疗的耐受等均与CSC相关,该理论提出了鼻咽癌难以治疗成功的具体原因之所在。肿瘤干细胞指的是位于肿瘤组织里面,在不需要外界因素的作用下可以更新,并在分化的过程中释放不同的异质性肿瘤细胞的细胞,它能够进行无限增殖和多向分化,在肿瘤细胞中其数量很少,不过在更新和分化方面有着巨大的潜力,而且还表现出耐药性、克隆形成能力以及肿瘤形成能力,提示与肿瘤的转移复发有关。CSC和正常干细胞具有相似的自我更新机制,采取不对称分裂的方式,即：一个CSC发生分裂后,就能够得到全新的CSC以及另一个子细胞,值得注意的是,通过这种分裂方式得到的子细胞会自我分化,并转变成为其他种类的细胞,包括肿瘤细胞。这种分类的结果是维持CSC数目的稳定并形成肿瘤。如何在传统治疗方式的基础上研究鼻咽癌干细胞,如特异性表面标志以及影响肿瘤干细胞的信号传导路径,从而寻求一种能够从根本上消灭鼻咽癌肿瘤干细胞而降低肿瘤复发概率的治疗手段,对提高鼻咽癌的五年生存率,具有重大意义。研究表明,在鼻咽癌细胞株中可以分离出侧群细胞(side population cell, SP cell),它们是对骨髓造血干细胞进行分离的过程中,综合应用DNA荧光燃料Hoechst33342以及流式细胞技术而首次探测到的细胞亚群,其具有自我更新、多向分化能力等一系列干细胞的生物学特征。有些学者指出,SP细胞属于原始的干细胞或者至少二者之间存在非常紧密的关联,表现在侧群细胞的自我更新、无限增值和强致瘤性等生物学行为特征方面,SP表型是各种来源的干细胞的普遍标志,因此SP细胞与CSC有很多共性,其可以富集CSC,对放化疗也具有抵抗性,由于迄今为止对鼻咽癌SP细胞研究的报道不多,因为鼻咽癌以未分化的鳞状细胞癌居多,本课题我们选用低分化的CNE-2细胞系作为研究的主要对象。从鼻咽癌CNE-2细胞系中分选出SP细胞,并研究其“干”性机制。健康机体的干细胞里面有一种Wnt/β-catenin信号转导通路,该通路是细胞实现更新、分化、凋亡功能的重要依赖。另外,机体对没有达到成熟的CSC的控制也离不开该通路,很多肿瘤的CSC里面都发现有Wnt/β-catenin信号转导通路的存在,该通路使得细胞具有了耐药性,并对肿瘤的复发进行介导,并且CSC干性的维持目前主要认为依靠Wnt/β-catenin信号转导通路。肿瘤细胞Wnt/β-catenin信号通路异常改变的关键因素是P-catenin降解障碍导致胞浆内游离的β-catenin聚集并与TCF/LEF结合进入细胞核内,启动下游基因转录。由于β-catenin的异常是鼻咽癌发生的常见事件,有研究表明其对鼻咽癌CSC特性的发挥过程而言是不可或缺的。现有的研究结论表明,Wnt/β-catenin信号通路对于SP细胞的增殖和分化也具有重要意义,但是Wnt/β-catenin信号通路在鼻咽癌SP细胞的作用机制研究却鲜有报导。恶性肿瘤的转移途径主要为三种,分别是种植转移、淋巴道转移以及血道转移,其中以淋巴道及血道转移为主要转移方式,这是一个十分复杂的多阶段连续的过程。肿瘤细胞是按照如下步骤进行转移的：肿瘤细胞开始浸润和发育,附着在基底膜上并寻求突破,从内皮细胞贯穿而入,并进入到血液循环系统里面,一旦到达靶器官组织上的血管部位后,就会停留,然后从停留部位的内皮细胞穿透出去,靶器官上就会出现转移灶。而在侵袭和转移的过程中,肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附是转移的决定性步骤之一。根据目前的研究成果,无论是肿瘤细胞附着在基底膜或其他细胞上,还是其自身的生长变化,都需要某种糖蛋白分子发挥作用,CD44基因表达后的产物是这种糖蛋白分子之一。它是肿瘤干细胞特异性表面标志物之一,其已确定为乳腺癌、胰腺癌、肠癌,头颈部鳞状细胞癌的CSC特异性表面标志物。鼻咽癌与头颈部其它鳞癌的病理类型一致和部位相近,使我们有理由推测CD44也可能也是鼻咽癌的特异性表面标志物。由于CSC干性的维持目前主要认为依靠Wnt/β-catenin信号转导通路,并且CD44又是Wnt/β-catenin信号通路下游区的靶基因,因此研究CD44的表达情况和CD44+SP细胞特性,对寻找鼻咽癌CSC以及如何抑制Wnt/β-catenin信号转导通路异常,达到改变该类CSC特性或杀灭该CSC,为制造抗鼻咽癌新药物或治疗方法提供前提。通过干扰Wnt/β-catenin信号通路以期改变或杀灭肿瘤干细胞的研究不多,一般认为可考虑通过小分子抑制物(siRNA)或者生物抑制物来阻断Wnt/β-catenin信号通路异常以改变肿瘤干细胞特性达到治疗目的,目前尚未见有关通过干扰Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌侧群细胞的影响的报道。因此本课题旨在从鼻咽癌CNE-2细胞中分选出SP细胞,并从SP细胞中再分选出CD44+细胞,研究鼻咽癌SP细胞中Wnt/β-catenin信号转导通路以及其下游靶基因CD44表达情况和CD44+SP细胞的体外生物学特性,了解Wnt/p-catenin信号通路在鼻咽癌SP细胞“干”性的机制研究,有利于寻找在效果方面表现更为突出,能够消灭鼻咽癌干细胞并将降低鼻咽癌复发率的全新治疗手段。本课题研究的主要内容为：(1)从人鼻咽癌细胞株低分化细胞系(CNE-2)中分选出SP细胞并培养;(2)从CNE-2 SP细胞中分选出CD44+SP细胞并培养；(3)检验CD44在鼻咽癌SP和NSP细胞的表达情况；(4)CNE-2细胞、CD44+SP细胞与CD44-SP细胞不同生物学行为的检测,包括体外培养的细胞生长率、迁移实验、平板克隆形成实验、细胞周期分析及对化疗药物的敏感性等实验；(5)通过转染β-catenin siRNA阻断Wnt/β-catenin信号转导通路,转染了β-catenin siRNA的细胞系中CNE-2细胞及CD44+SP细胞数量检测及生物学行为观察,包括体外培养的细胞生长率、迁移实验、平板克隆形成实验、细胞周期分析及对化疗药物的敏感性等实验。第一章CD44在鼻咽癌SP细胞中的表达及其意义目的本研究探讨CD44在人鼻咽癌SP细胞中的表达状况及其生物学意义。方法采用流式细胞仪对培养的人鼻咽癌CNE-2细胞进行分选以获得出CD44-SP细胞及CD44+SP细胞,通过细胞迁移实验、平板克隆形成实验、细胞周期分析及对化疗药物的敏感性等实验,统计分析CNE-2、CNE-2 SP、CNE-2 NSP、CNE-2 CD44+SP、CNE-2 CD44-SP各细胞之间的生物学差异。结果鼻咽癌CNE-2细胞中可以提取到2.3% SP细胞,其中36.5%的CD44+SP细胞。CD44+SP细胞的增殖能力、细胞迁移能力、平板克隆形成能力均显著高于其他细胞(P<0.05),对化疗药物的耐受性显著高于其他细胞(P<0.05)。结论鼻咽癌细胞是由不同的细胞所构成的,SP细胞就是其中之一,不过这种细胞的数量并不多,其分化能力很强,能够发展成为肿瘤细胞。由于CD44+SP细胞在鼻咽癌增殖生长以及化疗耐药方面起着重要作用,提示CD44可能可以作为鼻咽癌SP细胞表面的标志物之一。第二章Wnt/β-catenin信号通路调控下游基因CD44对鼻咽癌SP细胞中作用和意义目的Wnt/β-catenin信号通路在多种肿瘤中异常表达,CD44被证实为多种恶性肿瘤干细胞特异性表面标志物之一,本研究通过干扰Wnt/β-catenin信号通路,探讨Wnt/β-catenin信号通路调控下游基因CD44对鼻咽癌SP细胞的作用和意义。方法从鼻咽癌CNE-2细胞株中分离SP细胞及CD44+SP细胞培养及鉴定,阻断Wnt/p-catenin信号通路,了解CNE-2及CD44+SP细胞在体外的数量及生物学特性改变情况。结果鼻咽癌CNE-2细胞中可以提取到2.3% SP细胞,其中CD44+细胞占SP细胞的36.5%。CD44+SP细胞的体外增殖能力及对化疗药物的耐受性显著高于其他细胞(P<0.05),分别比较β-Catenin siRNA转染前后的CNE-2及CD44+SP细胞,各组细胞经转染后的增殖能力及克隆能力显著下降,而对化疗药物的耐受能力却显著增强,各组转染前后比较均具有统计学差异(P<0.05)。结论Wnt/β-catenin信号通路的异常与鼻咽癌CD44+SP细胞的生物学意义密切相关,干扰此通路可以改变鼻咽癌肿瘤干细胞特性。