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转基因动物自出现便引起了科学界的广泛关注,随着科学,医药的发展,转基因动物生物反应器如牛乳腺生物反应器得到了进一步的研究。鸡因其独特的生殖、鸡蛋内环境的稳定使得转基因鸡输卵管生物反应器成了药物蛋白生产理想的生物反应器。为了探究转基因鸡制备的方法,本研究进行了系统的研究。慢病毒载体显微注射法是制备转基因鸡的主要方法,为了探究影响显微注射转基因鸡孵化的因素,探究不同的开口位置对孵化率的影响,采取了钝端开口、赤道面开口的方式。结果显示:对照组孵化率90.00%;钝端开口组孵化率53.33%,赤道面组孵化率80.00%。可以看出,赤道面组孵化率明显高于钝端开口组。为了探究注射方式对鸡胚存活率、种蛋孵化率的影响,本实验进行了胚下腔、血管注射对比试验。结果如下:对照组孵化率93.33%;胚下腔注射组孵化率33.33%,血管注射组孵化率53.33%。可以看出,血管注射组孵化率明显高于胚下腔组。本研究设计了慢病毒载体,通过显微注射制备转基因鸡。采血后,通过Elisa鉴定,共有10只阳性鸡,但目的蛋白含量最高不超过100ng/m L。为了使鸡生产更多的目的蛋白且能够通过病毒载体法实现精准基因编辑鸡,本试验用腺病毒作为CRISPR/Cas9递送系统对鸡胚输卵管细胞、鸡胚成纤维细胞进行了敲入检测试验,尝试了将重组腺病毒直接注射到鸡胚中产生靶基因敲除鸡的方法,建立鸡CRISPR/Cas9重组腺病毒系统。通过提取转染了腺病毒CRISPR/Cas9的细胞基因组进行PCR扩增后,进行酶切,结果显示腺病毒递送CRISPR/Cas9在CEF中的靶向效率是40.7%。设计了三个供体腺病毒(HDR,HMEJ和MMEJ),与CRISPR/Cas9-tale腺病毒共感染CEF,测定CEF中的敲入效率。通过实验发现HMEJ的敲入效率最高。为了探究将供体递送到插入部位的方法,以进一步提高KI效率,构建了Cas9和转录激活器样效应器(TALE)的融合蛋白,并通过PCR从具有TALE靶向序列的HMEJ供体中扩增出三种不同的-HMEJ供体即5’-Bait-HMEJ,Inside-BaitHMEJ,5’-Bait-HMEJ。通过单细胞PCR,发现Inside-Bait-HMEJ在鸡胚成纤维细胞中敲入效率最高。探究了Cas-TALE+HMEJ,Cas-TALE+Inside-Bait-HMEJ腺病毒在输卵管细胞的敲入效率,进行Western blot检测。实验表明:CasTALE+HMEJ,Cas-TALE+Inside-Bait-HMEJ都可以敲入输卵管细胞,使其产生目的蛋白,Elisa实验表明Cas-TALE+Inside-Bait-HMEJ的敲入效率更高。本试验通过慢病毒载体赤道面显微注射血管成功制备了转基因鸡,验证了腺病毒作为CRISPR/Cas9递送系统可以对鸡胚成纤维细胞、鸡输卵管细胞敲入,为以后转基因鸡的生产提供了参考。