生物酶参与的氧化反应是一种绿色化学反应过程,但酶蛋白在氧化底物H₂O₂存在的条件下均易被氧化而失活。脂肪酶是一种能够介导进行环氧化反应的极具应用前景的酶类,但现有研究仍然缺乏有效方法提高酶耐受H₂O₂的能力,限制了其应用范围。本文以卡门柏青霉菌脂肪酶PCL（Penicillium camembertii lipase,PCL）为研究对象,通过探究脂肪酶PCL催化口袋与H₂O₂的关键结合位点,采用蛋白质工程技术进行分子改造,获得对H₂O₂耐受能力提高的脂肪酶PCL变异体。本研究为理性设计以提高工业酶的氧化稳定性提供了新的研究思路。（1）脂肪酶PCL的生物信息学分析。通过同源建模,获得了脂肪酶PCL的开放构象。使用分子对接构建了脂肪酶PCL-H₂O₂-戊酸的复合物构象,进一步分析脂肪酶PCL催化口袋中与H₂O₂的结合情况,并确定脂肪酶PCL催化口袋中与H₂O₂结合的重要位点Y21和H144。（2）通过突变实验推断脂肪酶PCL氧化失活的原因。构建酶与H₂O₂结合位点的突变体Y21F和H144W,用于模拟Y21和H144被氧化而极性消失的情况。实验结果表明,突变体Y21F和H144W的酶活力显著降低,在1 M H₂O₂浓度下孵育2 h后分别丧失了50%及80%的酶活力,相较之下PCL野生型仅丧失15%的酶活力,由此推测结合位点Y21和H144对将H₂O₂稳定在底物结合口袋中及维持酶催化效率起到重要作用。另外,结构分析表明酶催化口袋中Y21、H144和H259之间能够形成氢键,有助于稳定酶分子的催化口袋并将催化三联体中H259维持在合适的构象。（3）分子改造脂肪酶PCL提高其耐受H₂O₂能力的研究。设计在酶分子催化口袋中重要位点Y21和H144上方引入氢键供体,将脂肪酶PCL中H₂O₂结合口袋内非极性氨基酸替换为极性氨基酸,同时结合传统改造方法,共构建了8个突变体。其中突变体Y84R、I260E及I260R耐受H₂O₂能力都较野生型有了显著提高。分子对接实验表明它们都能与H₂O₂形成氢键相互作用,将H₂O₂分子稳定在Y21和H144的上方,有效避免Y21和H144直接与H₂O₂接触导致其被氧化失活。突变体Y84R、I260E和I260R的热稳定性都有显著提高,其半衰期t_1/2分别提高了7.0、3.3和15.7倍,且其T_m值分别增加了2.5、0.9和3.2℃,证明这三个突变体的结构稳定性都有所提高。结构分析表明,R84和R260能与周围氨基酸形成氢键或盐桥,以稳定酶分子的结构,使其热稳定性提高。（4）高过氧化氢耐受性突变体PCL-I260R催化烯烃环氧化反应的优势及应用。突变体PCL-I260R具有更好的耐受H₂O₂的能力,不仅表现在该突变体能在H₂O₂中更长时间维持活性,而且它能比PCL野生型耐受更高浓度的H₂O₂。PCL野生型在H₂O₂的浓度为3.33 M时,催化1-十八烯环氧化反应的转化效率达到最大值,而突变体PCL-I260R在4.44 M H₂O₂的条件下能达到最大转化效率。这表明相较PCL野生型,突变体PCL-I260R对H₂O₂的耐受上限提高了超过1 M,而能达到的最大转化速率也提高了57%。通过催化不同类型的烯烃,我们发现,具备高过氧化氢耐受性的突变体PCL-I260R已经能实现在无溶剂体系中高效催化烯烃的环氧化反应。