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根据刚果红与谷物β-葡聚糖紧密结合而显示红色的特征,采用“GCN平板法”和“改良琼脂块鉴定平板法”对本实验室保存的多株菌种进行初步筛选和摇瓶发酵复筛,得到一株产酶活力高、发酵周期短的β-葡聚糖酶生产菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)QYW-01。然后通过多次紫外诱变以及产酶驯化和筛选,获得一株β-葡聚糖酶高产突变株黑曲霉QYW-01A06,经过连续六次传代并分别测定各代菌株的产酶性能,确定该菌株在产酶能力方面具有较好的稳定性。黑曲霉QYW-01A06经摇瓶培养,发酵液酶活力可达125u/mL,是出发菌株QYW-01的2.6倍。
采用单因素实验和正交实验对黑曲霉QYW-01A06摇瓶分批发酵生产β-葡聚糖酶的培养基和发酵条件进行了研究,得出其最佳培养基配方为(g/100mL):大麦粉4.0,玉米浆1.0,(NH4)2SO40.3,NaNO30.2,FeSO47H2O0.01,MgSO40.02,CaCO30.5;最佳发酵产酶条件为:发酵初始pH值5.5-6.0,发酵温度31℃,装液量为80mL/500mL三角瓶,摇床转速为200rpm,接种量为2.0×105个孢子/mL发酵液,发酵周期为30小时。在最适产酶条件下进行摇瓶分批发酵,发酵液酶活力达318.4u/mL,是初始产酶条件的2.5倍。在摇瓶分批发酵的基础上进行摇瓶分批补料发酵实验,对补料材料、补料方式和补料时间进行了研究。结果表明在发酵28小时和30小时分两次补加6%的淀粉溶液和氮源溶液产酶效果比较好,虽然周期延长到了36小时,但是发酵液酶活力提高到了433.1u/mL,是分批发酵的1.36倍。
对10L发酵罐发酵产酶条件进行了初步研究,通过在不同种子培养基中观察菌种的生长速度、菌丝形态以及接种后的产酶情况,确定最佳种子培养基(g/100mL):葡萄糖1.0,大麦粉2.0,玉米浆1.0,(NH4)2SO40.3,NaNO30.2,MgSO40.02,FeSO47H2O0.01,CaCO30.5;种子培养条件:初始pH值5.5,温度31℃,80mL培养基/500mL三角瓶,转速200rpm;种龄16-20小时;大罐接种量10%(v/v)。结合摇瓶发酵条件确定了发酵罐发酵生产β-葡聚糖酶的基本工艺,并对间歇补料和连续补料分批发酵工艺作了初步探讨,发现在发酵中后期连续补加15%的淀粉溶液和复合氮源,发酵液酶活力可达385.2u/mL。
发酵液离心去除菌体后得到的粗酶液经硫酸铵分段沉淀,然后依次经SephadexG-25柱脱盐、SephadexG-75柱和DEAE-纤维素柱线性洗脱层析分离,得到纯化的酶,进行酶的部分性质测定。SDS-PAGE法和SephadexG-75柱层析法测定该酶的分子量在32.6-33.1kD之间。最适作用温度和pH分别为50℃和5.0,在50℃以下、pH3.0-5.5该酶相对比较稳定。