杆状病毒是一类有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80-180 kb，以节肢动物为其专一宿主，被广泛的用作昆虫杀虫剂，同时也被用作基因治疗的转移载体和真核表达载体。杆状病毒隶属Baculoviridae，根据其不同的形态学特征可将其划分为核型多角体病毒（NPV）和颗粒体病毒（GV）两类；根据其对宿主的特异性又可划分为Alpha杆状病毒、Beta杆状病毒、Gamma杆状病和Delta杆状病毒四类。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是一类典型的NPV病毒，它所引起的核型多角体病（血液型脓病）对养蚕业的危害极其严重，其造成的经济损失占整个蚕病损失的70％左右，严重影响了蚕丝的产量和质量，减少了蚕农的收入，威胁了我国蚕丝业的稳定和在国际市场上的主导地位。近年来，随着对BmNPV研究的深入，部分与BmNPV抗性相关的家蚕基因被鉴定出来，但是BmNPV的入侵机制始终未能解析清楚。本实验室建立并保存了两株来源于同一品种家蚕幼虫卵巢组织，但对BmNPV感染的敏感性存在显著差异的细胞系—BmN-SWU1和BmN-SWU2，其中BmN-SWU1细胞对BmNPV的感染极其敏感，而BmN-SWU2对BmNPV具有明显的抗性。在前期关于两株细胞系的差异研究中，发现BmN-SWU1和BmN-SWU2细胞系对BmNPV感染敏感性的差异主要是BmNPV入侵BmN-SWU2细胞的过程受到限制。本研究通过iTRAQ蛋白定量技术对BmN-SWU1和BmN-SWU2两株细胞系的蛋白质组差异进行了比较分析，筛选差异的膜蛋白特别是与受体功能相关的膜蛋白，期望通过对这些膜蛋白的研究来解释造成这一差异的主要原因，为阐明BmNPV入侵的详细过程奠定基础，也为从源头控制BmNPV的感染提供理论依据。主要的研究成果如下：　　1.BmN-SWU1和BmN-SWU2两株细胞系的蛋白质组差异分析　　本部分通过iTRAQ蛋白定量技术对两株细胞系进行了蛋白质组分析，通过质谱分析鉴定到18952个肽段，匹配到的蛋白质数量为3955个，并对所有鉴定出的蛋白进行GO功能注释分析。然后以BmN-SWU2为对照对BmN-SWU1和BmN-SWU2两个样品的的蛋白质丰度进行比较，共检测到629个差异蛋白，其中348个上调蛋白，281个下调蛋白。对这些差异表达的蛋白进一步筛选得到4个膜蛋白，对筛选到的膜蛋白进行深入的分析，鉴定到一个差异倍数大于5，且可能具有增强膜上受体功能作用的膜蛋白—BGIBMGA013777。荧光定量PCR检测的结果也证实该基因在BmN-SWU2中的表达量远低于其在BmN-SWU1中的表达量，由此我们将该蛋白锁定为目的蛋白。　　2.BmREEPa基因的鉴定及定位分析　　受体表达增强蛋白（REEP）是一类与细胞表面受体功能有关并且参与跨膜转运的蛋白，这一家族在不同物种之间高度保守。REEP家族成员均包含一个TB2/DP1，HVA22结构域及2-3个跨膜结构域。在脊椎动物中REEP家族一般存在5-6个成员分别命名为REEP1-REEP6，并且被划分成两个亚家族REEP1-REEP4和 REEP5-REEP6，而无脊椎动物中REEP家族的成员一般为2个。本部分通过对BmREEPa基因的序列分析发现该基因含有REEP基因保守的TB2/DP1，HVA22结构域和三个跨膜结构域；系统发生分析显示BmREEPa聚类在REEP5-REEP6亚家族中。通过免疫荧光和western blotting分析发现该基因定位于细胞质膜上且其N-末端伸向细胞外而C-末端面向细胞质；通过对该基因的表达模式分析发现其在家蚕五龄三天幼虫的中肠中和化蛹第一天时表达量最高，这一结果暗示该基因可能与脂类物质的代谢或运输相关。　　3. BmREEPa基因对BmNPV入侵的影响　　本部分通过在敏感细胞系BmN-SWU1和抗性细胞系BmN-SWU2中分别干涉和过表达BmREEPa基因，探索细胞水平BmREEPa基因对BmNPV入侵的影响，结果显示：在BmN-SWU1中干涉BmREEPa可以明显的抑制BmNPV对BmN-SWU1细胞的感染；在BmN-SWU2中过表达BmREEPa可以一定程度上解除BmN-SWU2对BmNPV入侵的抑制作用；同时BmREEPa可以与BmNPV入侵的关键囊膜蛋白GP64发生相互作用。利用显微注射技术创制了BmREEPa干涉的家蚕品系，通过注射和口服感染两种方式使转基因品系和非转基因品系家蚕幼虫感染BmNPV，然后通过致死率分析及病毒基因表达分析来验证该基因在个体水平对BmNPV感染的影响，结果发现BmREEPa干涉的家蚕品系中BmNPV的感染能力相比于非转基因家蚕品系被明显的抑制，且这种抑制主要存在于二次感染的过程中，即BV粒子对其它组织的感染。　　4.BmREEPa相互作用蛋白鉴定　　本部分以BmREEPa蛋白为诱饵蛋白通过免疫共沉淀的方法对BmREEPa的相互作用蛋白进行了筛选，鉴定到一个具有受体特性且与胆固醇运输相关的蛋白BmPtchd；通过进一步的验证发现BmREEPa、BmPtchd以及GP64可以形成一个蛋白复合体。通过研究BmREEPa和BmPtchd基因与胆固醇之间的关系发现，当细胞胆固醇升高时，BmREEPa和BmPtchd基因的表达量均上调，而当细胞胆固醇被移除时BmPtchd基因的表达量下调，而BmREEPa的表达量依旧上调。由此推测：BmREEPa可能在胆固醇代谢运输以及合成过程中都发挥作用，而BmPtchd基因可能仅在胆固醇代谢运输中发挥作用。　　本研究的结果表明，BmREEPa定位于细胞质膜上，且其N-末端对其定位具有重要的作用；该基因不论在细胞水平还是个体水平都对BmNPV的入侵具有影响，且这种影响主要针对于BV的感染；同时还发现该基因与细胞胆固醇的调节也有密不可分的关系，而胆固醇又是BmNPV入侵不可缺失的因子。综上所述，BmREEPa在整个BmNPV入侵的过程中发挥了重要的作用，此结果不仅为阐明BmNPV入侵的详细机制奠定了基础，同时也为REEP基因的研究提供了一个新的方向。