研究背景:肺癌是全球死亡率最高和发病率居第三位的恶性肿瘤,是我国严重威胁到居民健康的主要恶性肿瘤,最新资料显示肺癌已经是恶性肿瘤死因的第一位。虽然低剂量计算机断层扫描(CT)的广泛应用使得早期肺癌的发现率大大提高,更多的肺癌患者能在疾病早期就能得到治疗,但肺癌仍然是预后差的恶性疾病。近几十年来肺癌的治疗手段发生了巨大变化,从手术治疗、化学治疗、放射治疗三大传统手段,进展到靶向治疗和免疫治疗。针对肺癌驱动基因突变的分子靶向治疗极大地改变了肺癌的治疗方案,已成为治疗晚期肺癌患者的主要手段之一。由于肺癌驱动基因在肿瘤发生和促进肿瘤进展的信号通路激活方面发挥重要作用,因此靶向治疗与传统的细胞毒性化学治疗相比较,具有极高的有效率,且副作用小。肺癌驱动基因表皮生长因子受体(EGFR,epidermal growth factor receptor)酪氨酸激酶小分子抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)是用于靶向治疗具有受体酪氨酸激酶区域(EGFR 18,19,20和21外显子)存在突变的患者。根据相关统计资料,EGFR-TKI的使用,使得我国很多非小细胞肺癌患者受益,部分患者的生存时间大大提高。目前发现的肺癌肿瘤驱动基因有多种,很多与肿瘤靶向治疗相关。重要的肿瘤驱动基因包括:EGFR、ALK、Kras/Nras、Braf、ROS1、MET等等。随着研究进一步深入,越来越多的肺癌驱动基因会被发现,并有可能成为肺癌治疗新的靶点。酪氨酸激酶蛋白7(PTK7)是一种没有酪氨酸激酶活性的酪氨酸激酶受体蛋白,国内外多项研究发现其在结直肠癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、和宫颈癌等人类恶性肿瘤中异常表达,并且与肿瘤的增殖、侵袭力和转移等有关。但至今为止,有关PTK7基因在非小细胞肺癌中的相关研究非常少,关于其在肺癌中的作用和功能尚不清楚。本研究拟通过对一组肺癌细胞系和非小细胞肺癌(NSCLC)组织标本中PTK7基因的mRNA和蛋白表达水平进行检测,明确其在非小细胞肺癌中的表达水平,分析PTK7表达与临床病理指标之间的相关性,研究其临床意义。同时筛选出高表达PTK7的肺癌细胞系,通过转染针对PTK7基因的小干扰RNA(siRNA)抑制该基因的表达,下调PTK7后观察PTK7蛋白对肺癌细胞生物学功能的影响,初步研究PTK7基因对肺癌细胞的作用。由于PTK7是受体酪氨酸激酶的一种,而目前肺癌靶向治疗的药物主要是争对受体酪氨酸激酶EGFR突变和ALK融合基因,因此,我们进一步分析了 PTK7表达与这两种基因突变的相关性。材料方法:本研究所用人胚肺正常细胞和肺癌细胞均购自中国科学院上海细胞库,肺癌细胞株有:NCI-H292源自肺粘膜上皮细胞的淋巴结转移灶;A549非小细胞肺癌源自白人肺癌组织;NCI-H460人大细胞癌源自患者的胸水;NCI-H1734人非小细胞肺癌;MRC-5人胚肺细胞源自胎儿正常肺组织。采用定量PCR方法(qPCR)、Western blot和细胞免疫化学染色方法,检测了正常人胚肺细胞系(MRC-5)和肺癌细胞系(NCI-H292、A549、NCI-H460和NCI-H1734)中 PTK7 mRNA 和蛋白的表达水平。细胞培养在25mL Corning培养瓶中,培养基采用RPMI1640基础培养基添加10%胎牛血清,二氧化碳培养箱培养条件为37℃,5%二氧化碳和一定湿度。细胞总RNA提取采用Trizol,260nm/280nm波长测定提取的总RNA纯度和浓度,并通过MOPS变性胶检查提取RNA的质量。用DNase酶消化掉混入的基因组DNA。将2μg的总RNA应用Promega试剂盒逆转为cDNA。Q-RT-PCR:检测细胞系中PTK7的mRNA表达水平,管家基因GAPDH做内参标准化结果。培养的细胞达到90%以上融合率的时候,弃去培养基,用PBS缓冲液清洗3次,加入1ml冰上预冷的含10μl蛋白酶抑制剂混合物和10μl磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液提取肺癌细胞总蛋白。本研究收集了泰兴市人民医院胸外科2017年1月至2018年12月住院进行手术治疗的95例非小细胞肺癌患者的石蜡组织标本。所有患者在手术前均未接受化疗、放射治疗和其他手段治疗。患者包括男性48人,女性47人;平均年龄58岁;低分化肿瘤34例,中分化35例,高分化16例;淋巴结转移31例,无淋巴结转移62例。手术标本的取材及处理:手术组织标本在离体后30分钟内送至病理科,浸泡在足够量的10%中性福尔马林固定液中,固定8-12小时后进行病理取材。组织标本经过福尔马林固定后,再经过脱水、透明和浸蜡后,用包埋剂包埋成蜡块。所有使用的组织蜡块都经过病理诊断为非小细胞肺癌,诊断标准参考世界卫生组织(WHO)2015年颁布的肺肿瘤组织学分类及诊断标准,病理分期按国际抗癌联盟(UICC)公布的最新第8版肺癌TNM分期。通过免疫组织化学染色检测来源于非小细胞肺癌患者的组织标本中PTK7蛋白表达水平,并通过统计学分析研究肺癌组织中PTK7蛋白表达与临床病理指标的相关性。免疫组化结果判断标准:PTK7蛋白表达结果的判定依赖于着色细胞的染色强度和阳性细胞的比率综合评分。×400镜下随机选取5个视野观察。染色强度评分标准:组织几乎没有黄色为0分;淡黄色染色为1分;较明显黄色染色为2分;强棕黄色染色为3分。阳性细胞比率评分标准:阳性细胞数<5%为0分;阳性细胞数≥ 5%且<25%为1分;阳性细胞数≥25%且<50%且为2分;阳性细胞数≥50%且<75%为3分;阳性细胞数≥75%为4分。染色强度与阳性细胞评分分数相乘,以≥2分为阳性,否则为阴性。染色结果的评判由两位经验丰富的病理科医生独立进行读片,遇到两位病理医生判断不一致的情况时,通过相互商讨最终给出一致判断。对前期实验筛选出的高表达PTK7的肺癌细胞系A549,转染特异性针对PTK7基因的siRNA,观察其增殖、凋亡和迁徙能力的改变。细胞在转染前一天,使用24孔塑料培养板,传代细胞,使得细胞融合率达到90-95%。转染的培养基不含抗生素,选用OPti-MEMI专用培养基稀释Lipofectamine 2000。将稀释的PTK7 siRNA和Lipofectamine 2000轻轻混匀,加入细胞继续培养24-48小时。培养细胞消化后计算细胞数量,在96孔板中每孔加入1×104细胞和100μl培养基,每种细胞设平行3个孔,37℃,5%CO2条件培养过夜后,加入10μl CCK-8检测液,避免产生气泡。再孵育2小时,混匀后利用酶标仪在450 nm波长检测每孔的吸光度。转染细胞和对照细胞传代培养24小时,用不含有EDTA的2.5%胰蛋白酶消化培养细胞,加入1640培养基中止反应,以PBS缓冲液清洗细胞,2000rpm离心5分钟,重复一次,收集细胞2×105细胞。加入500 μl的Binding Buffer吹打悬浮细胞,加入5 μl AnnexiV-FITC混匀后,加入5μl PI(Propidium Iodide)混匀,室温下,避光反应10分钟。应用流式细胞仪检测。激发光波长选择488 nm,发射光波长选择530 nm.AnnexiV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1),PI红色荧光通过FL3通道检测。转染细胞和对照细胞传代培养24小时,细胞融合度达到60%以上时用20μl移液枪枪头在培养皿底部均匀划“一”字线。用PBS缓冲液漂洗2遍后更换不含血清的1640培养基继续培养24小时,观察并拍照。采用Image J软件,测量细胞划痕间的距离,用于评价转染细胞和对照细胞的迁移能力。采用北京天根公司(TianGen)生产的石蜡组织样本DNA提取试剂盒和北京雅康博生物科技有限公司生产的EGFR基因18-21外显子突变试剂盒,检测了肺癌组织的表皮生长因子受体(EGFR)基因突变。采用 Ventana Medical Systems 自动免疫组化分析仪,和 Ventana anti-ALK(D5F3)抗体检测ALK蛋白,并采用北京金菩嘉生产的ALK双色分离探针进行荧光原位杂交检测间变性淋巴瘤激酶基因(ALK)融合情况。统计学分析PTK7蛋白表达与EGFR基因突变和EML4-ALK基因融合突变的相关性。统计学分析:应用SPSS13.0软件进行统计学分析,相关性分析采用卡方检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。实验结果:测定非小细胞肺癌细胞株NCI-H292,A549,NCI-H460,NCI-H1734以及人胚正常肺细胞系MRC-5的PTK7表达水平,以内参基因GAPDH标化表达量。PTK7在正常肺细胞系 MRC-5 中不表达,在 NCI-H292,A549,NCI-H460,NCI-H1734肺癌细胞中不同程度表达。在肺癌细胞中的表达量依次降低:A549>NCI-H292>NCI-H1734>NCI-H460>MRC-5。其中 NCI-H292 和 A549 高表达,NCI-H460 和NCI-H1734 低表达。应用Western blot方法检测了 PTK7蛋白在非小细胞肺癌细胞株NCI-H292,A549,NCI-H460,NCI-H1734以及人胚正常肺细胞系MRC-5中的表达。PTK7蛋白在正常肺细胞中不表达,在非小细胞肺癌细胞中不同程度表达。应用细胞免疫化学方法,进一步验证了 PTK7蛋白在非小细胞肺癌细胞株NCI-H292,A549,NCI-H460,NCI-H1734以及人胚正常肺细胞系MRC-5中的表达情况。两种方法验证了 PTK7 mRNA表达水平和蛋白表达水平相符合。应用特异性PTK7多克隆抗体,检测了 95例包含正常肺泡上皮细胞和肿瘤细胞的经中性福尔马林固定的肺癌组织样本中PTK7蛋白的表达情况。PTK7蛋白在所有正常肺泡上皮细胞为阴性表达,在肿瘤细胞中的表达呈现多样化,从阴性、弱阳性、中度阳性到强阳性。PTK7蛋白主要在肿瘤细胞浆中表达,PTK7蛋白表达阴性肺癌有50例(占样本量52.6%),表达阳性的肺癌有45例(占样本量47.4%)。统计学分析发现PTK7蛋白表达与患者性别(P=0.024)和有无淋巴结转移有关(P<0.001),与患者年龄、原发肿瘤大小、肿瘤的分化程度以及细胞类型都无关。前期研究发现肺癌细胞系A549为高表达PTK7的细胞株,故选择其作为细胞水平PTK7基因敲出研究对象,利用CCK8试剂盒,检测比较转染PTK7 siRNA细胞和对照组细胞之间增殖的能力。研究结果表明肺癌细胞系A549细胞中PTK7被敲除后其增殖活力下降。细胞培养48小时后进行检测,细胞增殖实验结果显示,A549对照组平均的细胞活力为91%,转染siRNA的A549细胞活力平均值为63%,敲出了 PTK7基因的A549细胞增殖能力比对照组细胞有明显下降(P<0.05)。利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,检测转染PTK7 siRNA的A549细胞和对照组细胞之间凋亡情况。研究结果表明,肺癌细胞系A549细胞中PTK7敲除后凋亡率上升。细胞培养48小时后进行检测,细胞凋亡实验结果显示,A549对照组平均的细胞凋亡率平均为21%,转染siRNA的A549细胞凋亡率平均值为38%,敲出了 PTK7基因的A549凋亡率比对照组细胞明显上升(P<0.05)。利用培养细胞划痕实验,检测转染PTK7 siRNA的A549细胞和对照组细胞之间细胞迁徙能力。研究结果表明,敲出了 PTK7基因的A549细胞迁徙能力明显下降。高表达PTK7基因的肺癌细胞系A549空白对照组和用siRNA敲除PTK7基因的A549细胞在培养24小时后,用Image J软件分析两组细胞迁徙修复能力。A549空白对照组的划痕相对距离为:103.32±12.54;PKT7基因敲除组的A549细胞划痕相对距离为:1357.32±23.65。敲出了 PTK7基因的A549细胞迁徙能力比对照组细胞明显下降,两组具有明显差异性(P<0.05)。对非小细胞肺癌组织样本95例进行了 EGFR突变检测和EML4-ALK融合基因检测,EGFR检测到18-21外显子突变的47例,野生型的48例,EGFR突变阳性率为49.5%。EGFR突变多发生在PTK7蛋白阴性表达的患者(P=0.014)。检测的95例非小细胞肺癌中,共检测到EML4-ALK融合7例(7.4%),阳性的样本经过FISH进一步验证。本研究发现EML4-ALK基因融合更容易发生在PTK7蛋白阳性表达的患者(P=0.050)。研究结论:PTK7基因在人胚肺细胞系和正常肺泡上皮细胞中均不表达,在非小细胞肺癌细胞中不同程度表达。与正常肺组织细胞相比较,PKT7基因的mRNA和蛋白在非小细胞肺癌中表达增加。非小细胞肺癌中的PTK7蛋白表达水平与性别和淋巴结转移相关,与其他病理指标不相关。PTK7蛋白表达还与EGFR突变和EML4-ALK融合有关。在细胞水平将PTK7基因敲出后,细胞的增殖力下降,凋亡率上升,迁徙力下降。本研究结果初步提示PTK7基因在非小细胞肺癌中呈现癌基因的作用。本研究为非小细胞肺癌中PTK7基因功能的初步研究,其研究结果为将来深入研究其在肺癌发生、发展、转移和预后的作用及分子机制提供了重要线索。也可能为进一步研究针对PTK7高表达的肺癌进行靶向治疗提供重要依据。