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中国是荔枝的起源中心,也是世界荔枝生产的第一大国,蕴藏着丰富的种质资源,但是荔枝的遗传育种研究还相对落后。因此,探索荔枝品种系统演化,研究荔枝种质资源科学分类,开展杂交育种工作研究,以及进行优良新品种和优稀品种的发掘、鉴定与利用,都是荔枝育种工作中亟待解决的问题。
本研究以SRAP分析为主要分析手段,在前人基础上继续构建高密度荔枝分子遗传图谱并初步开展童期性状的QTL分析,可为今后的分子育种奠定必要的基础;另外,对一些重要的栽培品种和一些创新种质的遗传分子标记研究,也可为荔枝相关种质资源鉴别、系谱分析和分类提供新的证据,为这些种质资源的正确评价和合理利用提供分子水平上的依据。本研究获得的主要结果如下:
1.利用正交设计L16(45)对荔枝SRAP-PCR反应体系中的五个因素(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶)的四个水平进行优化试验,最终确立了荔枝SRAP-PCR反应的优化体系为:1×PCR Buffer,MgCl23.0 mM,dNTPs0.2 mM,正、反向引物各0.2μM,模板DNA15ng,Taq DNA聚合酶1.5U。
2.以“马贵荔×焦核三月红”F1代的83个单株为作图群体,筛选出扩增谱带稳定、多态性条带丰富、分离位点数量多的13对SRAP引物,对大群体进行SRAP-PCR分析,共获得母本特有位点138个,父本特有位点95个,双亲共有位点38个,经x2检验,共有99个位点偏离孟德尔分离,偏分离标记的比例为36.53%。其次,综合前人(刘成明,2001;刘睿,2005;张斌,2008)获得的分离标记(RAPD和AFLP),采用JoinMapR3.0软件进行连锁分析,新构建了马贵荔和焦核三月红的分子遗传图谱各一幅。其中,马贵荔的分子遗传图谱含297个标记,形成18个连锁群,覆盖总图距990.3 cM,位点之间的平均遗传距离3.3 cM;焦核三月红的分子遗传图谱含有288个标记,形成16个连锁群,覆盖总图距811.9 cM,位点之间的平均遗传距离为2.8 cM。
3.利用13对SRAP引物对作图群体的83个单株及其双亲进行SRAP-PCR扩增,共获得271个SRAP多态性位点、115个单态性位点和13个新位点,采用NTSYS-Pc软件进行相似性分析和聚类分析,结果表明,父本焦核三月红和母本马贵荔的相似系数为0.593,是供试荔枝品种中亲缘关系最远的两个品种,包括父母本在内的作图群体的相似性系数范围为0.593~0.901,并主要集中在0.675~0.850范围之间。从聚类结果可以看出,大部分F1单株与母本马贵荔优先聚为一类,说明作图群体的母性遗传效应比较明显。
4.利用SRAP标记对来自广东、广西、福建、海南和云南5个省区的32份荔枝品种(系)、特殊种质“龙荔”和龙眼属的石硖品种进行分析,共获得339个SRAP位点,其中多态性位点为338个,占总位点数的99.7%,说明32个供试材料之间的遗传多样性比较丰富。NTSYS-Pc的运算结果表明,供试材料之间的相似性系数在0.481~0.993范围之内,其中荔枝品种间的相似性系数范围为0.536~0.993,说明供试荔枝种质间的遗传差异普遍较大,而且也能区分非常近缘的种质材料。根据聚类分析树状图,本研究在相似系数大约为0.72的水平上,可将这32份种质分为5组,这一分类结果与以成熟期性状的分类结果具有较好的一致性。
5.应用MapQTL4.0对作图群体的童期性状进行初步的QTL定位。结果表明,在母本马贵荔遗传图谱中检测到1个在Kruskal—Wallis检验和区间作图上都达到0.05显著性水平的位点,即*F05—1042,分布在连锁群mLG7上,其解释表型方差的比例为11.3%。在父本三月红遗传图谱中检测到在Kruskal—Wallis检验和区间作图上分别达到0.05和0.1显著性水平的位点各1个,达到0.05显著性水平的位点为SAm8e3—670,分布在连锁群sLG3上,其解释表型方差的比例为83.5%,故初步推测在童期性状的遗传控制上有主效基因存在。另外,在区间作图检测中,连锁群sLG3上有三个峰(其中可检测到2个标记位点MSAm5e8—400和MSAm3e3—850)能满足全基因组中的0.05水平上显著的要求,其解释表型方差的比例分别为80.5%、85.6%和79.6%,可见,在sLG3上很可能有与控制童期性状有关的主效基因存在。
综上所述,本研究采用SRAP分析在荔枝高密度分子遗传图谱构建、重要品种资源的亲缘及系谱关系、童期性状的QTL定位、以及遗传多样性分析和种质鉴定等方面取得了较好的结果,为后续研究奠定了比较坚实的基础。