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类固醇激素在脊椎动物的生殖、发育、生长等方面都有着十分重要的作用。其合成是由一系列类固醇合成酶控制的。其中3β-HSD(3p-hydroxysteroid dehydrogenase)和StAR(Steroidogenic acute regulatory protein)是类固醇激素合成通路上的两个关键酶。鱼类基因组和转录组测序数据库的陆续完成为类固醇合成分子机制的深入研究提供了前所未有的机遇和平台。本研究从尼罗罗非鱼中分离出两种3β-HSD基因和两种StAR基因。其中3β-HSD-Ⅰ和3β-HSD-Ⅱ的基因结构相差较大。同源性比较和系统发生分析发现,3β-HSD-Ⅰ和3β-HSD-Ⅱ能够分别聚为一枝。共线性分析发现,脊椎动物3β-HSD-Ⅰ和3β-HSD-Ⅱ分别位于不同的染色体上,在其上下游分别具有保守的基因座位。StAR-Ⅰ和StAR-Ⅱ的基因结构十分相似。系统发生分析发现,硬骨鱼类的StAR-Ⅰ基因以及脊椎动物的StAR基因聚为一枝,而硬骨鱼类的StAR-Ⅱ基因聚为不同的进化枝。此外,尼罗罗非鱼StAR-Ⅰ和StAR-Ⅱ都与其他物种的对应基因同源性较高。除了硬骨鱼类外,并没有在其他物种发现StAR-Ⅱ基因的存在,这有力地支持了硬骨鱼类在进化史上具有独特的第三次基因组复制这一假说。共线性分析发现StAR-Ⅰ和StAR-Ⅱ分别位于两个不同的连锁群上,并且两者附近没有相同的基因。其中硬骨鱼类StAR-Ⅰ和脊椎动物StAR基因有十分保守的基因座位顺序,表明他们可能是直系同源基因。通过Real-Time PCR和原位杂交实验分别研究了3β-HSD和StAR在成体罗非鱼不同组织、个体发生过程、产卵循环、以及性逆转过程中表达模式,发现两个复制基因具有时空表达的差异,因此我们推测他们在罗非鱼类固醇合成过程中,可能具有不同的功能。首先,他们具有不同的组织分布表达模式。通过Real-Time PCR发现3β-HSD—Ⅰ王要表达于头肾和精巢中,3β-HSD-Ⅱ在肾脏、卵巢和精巢中表达较高；StAR-Ⅰ主要表达于头肾、肾脏和精巢,StAR-Ⅱ在卵巢和精巢中表达较高。通过原位杂交发现3β-HSD—Ⅰ表达于头肾的肾间细胞和精巢的间质细胞,3β-HSD-Ⅱ表达于卵巢的卵母细胞；StAR-Ⅰ在头肾的肾间细胞、卵巢的卵母细胞、精巢的间质细胞中均有表达,StAR-Ⅱ主要表达于卵巢血管周围的一些组织和精巢的间质细胞。值得注意的是,3β-HSD-Ⅰ和StAR-Ⅰ都能够在头肾的肾间细胞中表达,而3β-HSD-Ⅱ和StAR-Ⅱ却不能在头肾中表达。由此我们可以推断：头肾中可的松的合成可能与3β-HSD-Ⅰ,StAR-Ⅰ等基因的表达有关,而两个复制基因的其中之一特异性地表达于头肾。其次,3β-HSD和StAR及其复制基因在个体发生过程呈现雌雄差异和时空差异的表达模式。通过Real-Time PCR可以看出,3β-HSD-Ⅰ在孵化后5天的XX性腺中开始表达,然后其表达量一直上调,直到孵化后30天达到最高值,随后急剧下调；在XY性腺中的表达也是始于孵化后5天,随后其表达量基本保持上调趋势。3β-HSD-Ⅱ在早期XX性腺中的表达量维持在较低水平,从孵化后60天才开始急剧上升,然后一直保持上调趋势,而在XY性腺中早期表达较低,直到成体(12m)才出现明显上调。StAR-Ⅰ在XY性腺中的表达量从孵化后30天开始一直处于上升趋势,在XX性腺中的表达量始终处于较低水平。StAR-Ⅱ在XY性腺中的表达与StAR-Ⅰ一致,其在孵化后5—30天的XX性腺中的表达明显升高,随后出现下调。通过原位杂交可以发现,3β-HSD-Ⅰ在孵化后10天以后的雌雄性腺的体细胞中均可检测到其表达；3β-HSD-Ⅱ在早期的XY性腺中未见表达；StAR-I只在孵化后30,60天的XY性腺体细胞中表达；StAR-Ⅱ在孵化后5天开始,在XX性腺中均有表达,而在XY性腺体细胞中只在孵化后30,60天才有表达。综上所述,由于尼罗罗非鱼的性别决定时期为孵化后5天,因此我们推测StAR-Ⅱ可能在卵巢的性别决定和分化过程中有重要作用。通过Real-Time PCR分析发现,在整个产卵周期中,3β-HSD-Ⅰ表达相对较高,说明其可能与卵子成熟有关；而3β-HSD-Ⅱ在整个过程中表达量都相对较低。StAR-Ⅰ的表达从产卵后第一天开始逐渐上升,在产卵后第10天达到最高值,随后逐步下降,这与成熟诱导激素(17,20β-dihydrozy-4-pregnen-3-one,DHP)在产卵周期中的合成时间一致,似乎暗示了StAR-Ⅰ可能与卵细胞的成熟有紧密联系,而StAR-Ⅱ在整个产卵循环中表达量都处于较低水平,说明StAR-Ⅱ可能没有参与产卵循环过程。在通过letrozole对3月龄罗非鱼长期处理的性逆转过程中,基因型未发生变化,表型由雌性逆转为雄性。通过Real-Time PCR分析发现,随着性逆转的进行,3β-HSD-Ⅰ的表达量逐渐升高,而3β-HSD-Ⅱ的表达量先升高后下降,这有可能是代偿性的升高导致；StAR-Ⅰ和StAR-Ⅱ都表现出逐渐升高的趋势。通过原位杂交可以看出,3β-HSD-Ⅰ表达于卵精巢的精巢部分和性逆转精巢的间质细胞。3β-HSD-Ⅱ表达于卵精巢的卵巢部分。StAR-Ⅰ和StAR-Ⅱ均表达于卵精巢的精巢部分以及性逆转精巢的间质细胞。以上说明3β-HSD和StAR的表达都只与表型有关,因此在性逆转过程中可能有重要作用。通过荧光素酶报告基因启动子分析,我们发现CREB-O和CREB-T两个转录因子对3β-HSD-Ⅰ,3β-HSD-Ⅱ,StAR-Ⅰ,StAR-Ⅱ基因均有上调作用,并且存在着剂量依赖作用。综上所述,我们从尼罗罗非鱼中分别分离出两种3β-HSD基因和两种StAR基因,研究发现它们可能在性腺发育的不同时期,性逆转过程和头肾可的松合成中担任不同的角色。序列保守性和进化树分析表明StAR(鱼类StAR-Ⅰ)在整个脊椎动物都比较保守,而StAR-Ⅱ是硬骨鱼类特有的基因,它可能是在硬骨鱼类特有的第三次基因组复制过程中出现的。而3β-HSD的复制在整个脊椎动物都是存在的,表明其复制可能发生在脊椎动物前两次基因组复制过程中。表达分析表明3β-HSD-Ⅰ和StAR-Ⅰ在头肾中的肾间细胞中高水平表达,我们推测它们可能参与头肾可的松的合成。3β-HSD-Ⅰ和StAR-Ⅰ在成体性腺的精巢中大量表达,推测它们可能在雄激素的合成和精巢的维持过程中有重要作用。另外,StAR-Ⅰ的表达水平在产卵循环中的卵子成熟阶段迅速上调并达到最高峰,因此可以推断StAR-Ⅰ可能在卵子成熟过程中促进DHP的合成。3β-HSD-Ⅰ在整个产卵循环过程中保持高水平表达,并且在产卵后10天出现明显上调,因此我们推测其在整个产卵循环,特别是卵子成熟阶段有重要作用。3β-HSD-Ⅱ特异性的表达于成鱼的卵巢中,所以它可能与尼罗罗非鱼卵巢的维持和雌激素的合成有关；StAR-Ⅱ表达于早期的卵巢和成鱼的精巢中,因此可以推断它可能参与了幼鱼时期卵巢的分化及成鱼时期精巢的发育和雄激素的合成。转录因子CREB-O和CREB-T分别特异地在卵巢和精巢表达,但都能刺激对3β-HSD和StAR基因表达,因此我们猜测罗非鱼类固醇激素的合成受cAMP信号通路的调节,并且该信号通路的基因在雌雄鱼存在明显差异。