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研究背景及目的:1.恶液质的定义及流行病学恶液质(cachexia)亦称恶病质,是由两个拉丁文词根Kakos(坏的)和Hexia(状态)构成,表示患者的极差的状态。患者通常表现为体重迅速下降、极度消瘦,厌食、恶心、无力,体能极差,最终多种器官功能障碍等综合征。既往认为恶液质是多种疾病的终末期,甚至是生命的终末期。随着对恶液质研究的深入,期望能早期发现恶液质的启动状态,从而为临床治疗争取机会。2011年发表在Lancet Oncol上的癌症恶液质定义与分类中指出,恶液质是一种骨骼肌量进行性下降的多因素综合征,伴随或不伴随脂肪量减少,不能被常规的营养支持完全逆转,最终导致进行性功能障碍。突出为:以持续性骨骼肌丢失为特征,伴有或不伴有脂肪组织丢失;不能被常规营养支持完全缓解;逐步导致功能损害;多因素综合征[1]引起恶液质的疾病包括,包括恶性肿瘤、慢性心衰、慢性肾衰、AIDS、严重创伤、吸收不良及严重的败血症等,其中以恶性肿瘤伴发的恶液质最为常见,称为肿瘤恶液质。致病因素通过各种途径激活细胞内多种信号通路、机体内多种负向细胞因子分泌,使机体代谢发生复杂的负向改变。同时,患者厌食明显,对各种营养素消化吸收障碍,导致机体进一步代谢紊乱,进入恶液质状态。消化道肿瘤患者的恶液质发生率高,肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等晚期癌症也都呈现恶液质状态。2.恶液质的核心是骨骼肌减少有报道称,进展期肿瘤约60%-80%的患者会出现恶液质[2],实际上,恶液质在肿瘤进展的早期阶段即可出现。《欧洲肿瘤恶液质临床指南》中将肿瘤恶液质分为三期[3]:恶液质前期、恶液质期、恶液质难治期。目前将体重下降作为恶液质最主要的临床表现,肌肉丢失是恶液质最核心的特征,由于精确测量体成分较难开展,因此临床将体重丢失作为恶液质最主要的临床表现。3.成年人骨骼肌始终处于肌肉蛋白质合成与降解的平衡中,而恶液质患者的肌肉减少主要源于肌肉蛋白质合成的减少与降解的增强或加速。机体骨骼肌蛋白降解主要有三条信号通路:溶酶体蛋白酶途径(lysosomal protease)、钙依赖的蛋白酶途径(calcium-dependent protease)和ATP-泛素-蛋白酶体途径。研究显示,恶液质时ATP-泛素-蛋白酶体途径中泛素化酶MuRF1(muscle ring finger-containing protein 1,又名TRIM63)和MaFbx(muscle atrophy F-box protein,又名atrogin 1、FBXO32)活性异常增强与骨骼肌蛋白的降解密切相关。恶液质患者可产生众多促炎症细胞因子,包括肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)、蛋白水解诱导因子(proteolysis-inducing factor,PIF)白介素-1(interleukin-1,IL-1)、白介素-6(IL-6)及γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)等。这些细胞因子可直接作用于骨骼肌细胞,结合相应的受体并激活细胞内的多种信号通路,进一步促进ATP-泛素-蛋白酶体途径的蛋白质降解。与骨骼肌蛋白合成与降解均相关的另一条重要信号途径是胰岛素生长因子-1(IGF-1)的相关通路。在IGF-1下游的分子中,PI3K/AKT地位较为突出,AKT下游分子有促进肌肉合成的GSK-3β、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein,mTOR)、p70S6K等,也有促进肌细胞分解促使肌肉萎缩的FOXOs家族分子及E3酶相关泛素化分子MuRF1和MaFbx。此外,有学者研究发现,肌细胞生成抑制素Myostatin在肌肉细胞生长和分化过程中起着负调节作用,Myostatin引起肌肉萎缩、肌蛋白降解的途径与IGF-1-PI3K-AKT通路相似,主要是通过调节PI3K下游的AKT、FOXO等分子,进而激活MuRF1和MaFbx两泛素化分子,促使肌蛋白降解,肌肉减少。目前针对恶液质尚无明确的治疗措施,临床上主要是给予恶液质患者联合用药以增加合成代谢、减少肌肉降解、纠正炎症状态并给予营养支持,控制恶液质症状以达到改善机体功能和延长预期寿命的目的。4.左旋肉碱的潜能左旋肉碱(L-carnitine),是一种小分子类氨基酸,其主要功能是促进长链脂肪酸的β-氧化,在细胞能量代谢中起着重要作用。肉碱可以改善蛋白质代谢,促进蛋白质合成;可以改善心功能,改善心肌缺血症状;可以清楚自由基,保护肝脏;此外,肉碱还具有抗氧化,促进机体器官代谢等功效。肉碱缺乏会导致乏力、虚弱、心绞痛、心律失常等症状。所以,临床上常将肉碱用于心血管系统、神经系统、肝脏、肾脏等诸多疾病的治疗。本研究从细胞和动物两个层面模拟肿瘤恶液质的模型,给予其肉碱处理,观察肉碱是否可以抑制肿瘤恶液质导致的骨骼肌萎缩,结合效应和机制进行研究,旨在为恶液质的治疗提供新的参考。研究内容:1.肉碱促进小鼠骨骼肌C2C12细胞分化的效应研究以TNF-α抑制小鼠骨骼肌C2C12细胞分化为恶液质肌肉减少的细胞模型,给予不同浓度肉碱干预,观察肉碱抵抗TNF-α对C2C12细胞分化抑制的效应。通过形态学观察肌细胞肌管的形成状态,明确肉碱的干预效应。2.肉碱经AKT/p70S6和AKT/FOXO3a通路调控肌肉蛋白降解的效应与机制研究针对上述肉碱干预的恶液质模型分不同时间点和不同浓度的肉碱两种条件进行研究,对其提蛋白后采用蛋白免疫印迹法Western Blotting方法检测AKT/FOXO3a通路相关分子的蛋白表达情况,明确肉碱干预的机制。3.肉碱经AKT/p70S6和AKT/FOXO3a通过调控肌肉蛋白降解的效应与机制验证针对上述TNF-α诱导的恶液质模型,在其骨骼肌形成前,予以siRNA-AKT处理,抑制AKT的表达,从效应和机制两方面观察给予肉碱干预后,肌蛋白的形态和AKT/p70S6和AKT/FOXO3a通路下游相关分子的蛋白表达情况,验证肉碱可调控肌肉蛋白的降解。具体实验方法如下:A.采用基本细胞培养技术对小鼠骨骼肌细胞系C2C12进行传代培养和诱导分化;B.结晶紫染色观察C2C12成肌细胞分化程度;C.倒置显微镜观察不同浓度肉碱对肌细胞形态的影响;D.构建抑制剂AKT-siRNA;E.加入AKT的抑制剂siRNA后观察细胞分化程度的变化;F.Western blotting实验检测肉碱对CPT1、AKT、P-AKT、p70S6K、P-p70S6K、FOXO3a、P-FOXO3a、MuRF1、MaFbx、Myostatin蛋白表达的影响。实验结果:1.肉碱促进肌细胞肥大并抑制TNF-α诱导的肌纤维萎缩用TNF-α处理小鼠骨骼肌细胞C2C12作为体外骨骼肌萎缩的研究模型。我们实验结果显示,诱导C2C12细胞分化3天后再给予TNF-α和肉碱干预48小时,分化的骨骼肌肌管有不同的形态显示,TNF-α处理的恶液质模型组肌纤维直径最小,其余肌管直径从小到大依次为对照组、100μg/mL肉碱组和1000μg/mL肉碱组。Western Blotting结果显示,1000μg/mL肉碱干预组的肌蛋白降解的两个关键泛素化酶:MuRF1和MaFbx的蛋白表达量均较恶液质(TNF-α)模型组明显下降。2.肉碱诱导AKT/p70S6K通路活化,降低FOXO3a蛋白表达,促进FOXO3a磷酸化骨骼肌肌管的增粗主要与肌细胞内的AKT/p70S6K途径的激活有关,我们研究显示,100μg/mL或1000μg/mL两种浓度的肉碱干预后,AKT通路的上下游相关分子P-AKT、P-p70S6、P-FOXO3a的表达较恶液质组上升,P-AKT/AKT、P-p70S6K/p70S6K、P-FOXO3a/FOXO3a比值升高,且1000μg/mL浓度的肉碱组升高更为明显;1000μg/mL浓度肉碱干预效果的时相研究显示,24小时内肉碱上调促进肌管增粗相关AKT/p70S6K途径部分分子的表达,具有时间依赖性,其诱导的P-AKT、P-p70S6在干预后24小时均达到蛋白质表达高峰。3.肉碱逆转经由AKT通路抑制TNF-ɑ诱导的肌纤维萎缩用AKT的抑制剂siRNA-AKT干预TNF-ɑ诱导的C2C12细胞,再给予其1000μg/mL浓度的肉碱干预,结果发现:肉碱干预组,肌纤维直径较未干预组纤维直径明显增大;且施以siRNA-AKT处理组的肌纤维较空白质粒对照组肌纤维变细。Western Blotting结果显示,给予siRNA-AKT处理的实验组AKT/p70S6K和AKT/FOXO3a通路下游相应分子蛋白表达中,促进肌纤维增粗的分子如p70S6K等表达下降,抑制肌纤维合成的分子如FOXO3a等分子表达上升;肉碱干预后,情况得以逆转。实验结论:肉碱干预可以抑制TNF-ɑ诱导的肌纤维的萎缩,降低恶液质状态下肌纤维萎缩的程度,且该作用经由AKT/S6/FOXO3a通路实现。肉碱干预可能是一种有希望的防治恶液质时肌肉减少的措施。。