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SETD4（SET domain-containing protein 4）蛋白是课题组前期在利用蛋白质组学技术研究脓毒性休克的发生机制时发现的差异蛋白,属于SET蛋白家族中的一个成员。已有不少研究证明该家族成员参与炎性疾病的发生发展,但是SETD4在其中的作用仍不清楚。前期研究中发现脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激Raw264.7细胞后,SETD4蛋白表达上调;干扰SETD4后,LPS刺激所致的炎症因子生成减少,提示SETD4参与炎症反应。为了进一步研究SETD4在炎症反应中的作用,课题组前期构建了全身性SETD4基因敲除小鼠,并发现SETD4的敲除可以显著减少LPS诱导的炎症因子的生成并提高内毒素血症小鼠存活率。本研究的目的是基于SETD4基因敲除小鼠,探讨SETD4是否同样参与其他Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）激动剂如细菌脂蛋白（bacterial lipoprotein,BLP）或聚肌苷酸-聚胞苷酸（polyinosinic acid-polycytidylic acid,Poly（I:C））介导的炎症反应;SETD4介导的全身炎症反应对内毒素血症小鼠重要脏器肝脏、肺脏病理损伤程度的影响;并构建和鉴定髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为深入研究SETD4的生物学功能提供更精准的动物模型。本研究分为以下两部分:第一部分:基于SETD4基因敲除小鼠探讨SETD4在炎症反应中的作用。首先利用不同TLR激动剂,即BLP或Poly（I:C）分别刺激SETD4+/+小鼠BMDMs不同时间点,qPCR检测SETD4的mRNA水平;随后又利用BLP或Poly（I:C）分别刺激 SETD4+/+、SETD4-/-小鼠 BMDMs,qPCR 检测 TNF-α和 IL-6的mRNA水平,并通过liquidchip液相蛋白芯片技术检测细胞培养上清中TNF-α和IL-6的蛋白水平。此外,选取SETD4+/+、SETD4-/-小鼠,分为LPS实验组和Sham对照组,12 h后取肝、肺组织,HE染色观察组织病理损伤情况。第二部分:髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠的构建与鉴定。将引进的SETD4flox/+小鼠先进行自交,筛选出子代基因型为SETD4flox/flox的小鼠;与FLP小鼠杂交,获得子代基因型为SETD4fl/+;flp小鼠;后分别与C57BL/6小鼠杂交,筛选出子代基因型为SETD4fl/+小鼠,与Lyz2-Cre小鼠杂交,筛选出子代基因型为 SETD4fl/+;Lyz2-Cre 小鼠;最后将 SETD4fl/+和 SETD4fl/+;Lyz2-Cre 小鼠杂交,筛选出子代基因型为SETD4-/-;Lyz2-Cre和SETD4fl/fl小鼠,即髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠及其对照鼠。通过PCR以及琼脂糖凝胶电泳鉴定每代小鼠基因型。RT-PCR、qPCR检测SETD4-/-;Lyz2-Cre和SETD4fl/fl小鼠腹腔巨噬细胞和肝脏组织中SETD4的mRNA水平,验证敲除情况。本论文已取得如下初步结论:1.不同种类TLR激动剂均上调BMDMs中SETD4的mRNA水平,且敲除SETD4后,TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白水平均显著下调。说明SETD4参与不同TLR激动剂介导的炎症反应,且均发挥正调控作用。2.HE染色观察组织病理损伤时,发现LPS刺激12 h后SETD4-/-小鼠肺组织病理损伤较SETD4+/+小鼠明显减轻,而在肝组织中无显著差异,说明SETD4的敲除在一定程度上减轻炎性刺激造成的肺组织病理损伤,这可能是提高内毒素血症状态下SETD4基因敲除小鼠存活率的原因。3.利用FLP/FRT和Cre/Loxp位点特异性重组酶系统,将SETD4flox/+小鼠先后与FLP小鼠、C57BL/6小鼠、Lyz2-Cre小鼠杂交,最终可以成功获得SETD4-/-;Lyz2-Cre纯合子小鼠,即髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠。综上所述,本研究利用全身性SETD4基因敲除小鼠,对SETD4在不同类型TLR激动剂介导的炎症反应及内毒素血症诱导的组织病理损伤中的作用进行了初步的分析;并进一步构建了髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为后续深入研究SETD4的生物学功能奠定基础。