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实验目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system,CNS)炎性脱髓鞘病变为主要病理改变的自身免疫性疾病,多以症状、体征的反复发作与缓解交替为特点。自MS开始发病时,轴突变性、神经元死亡等功能障碍和结构损伤的病理特征便已出现,并且在疾病的缓解期,该病理损伤也呈进行性与累积性。因此,在MS的缓解期间用药能对髓鞘、轴突的再生起到重要促进作用。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是从传统补肾中药淫羊藿中提取出的有效单体成分,既往报道称其具有神经保护功能、对抗氧化应激诱导的神经变性及提高记忆力的作用。为进一步探究ICA对髓鞘再生修复的作用及其机制,本实验采用cuprizone(CPZ)诱导C57BL/6J小鼠制备髓鞘脱失的MS模型,从轴突完整性、成熟少突胶质细胞数量、神经再生等角度观察,探究ICA促进髓鞘再生修复作用的可能机制,为MS治疗药物的开发提供新的实验依据。实验方法:1、以掺入含有0.2%w/w cuprizone(CPZ)的常规啮齿类动物饲料饲喂C57BL/6小鼠制备急性髓鞘脱失动物模型,饲喂5周,诱导其发生急性脱髓鞘和少突胶质细胞凋亡,随后更换为不含CPZ的常规饲料饲喂小鼠1周诱发髓鞘自行修复。实验分为6组:对照组、溶媒对照组、CPZ模型组、CPZ+ICA 6.25、12.5、25 mg/kg/day组。再生修复期间,各剂量ICA组经口腔灌服相应剂量的受试药物ICA,溶媒对照组灌服ICA配制溶剂(0.5%羧甲基纤维素钠溶液),对照组和CPZ模型组均灌服等体积蒸馏水。每周记录各组小鼠体重变化。2、分别于CPZ造模5周后及再生修复1周后取小鼠脑组织,采用坚牢蓝(Luxol fast blue,LFB)染色法观察脑内胼胝体区的髓鞘脱失的变化;采用免疫组织化学染色法观察髓鞘脱失和再生的形态学变化;采用免疫荧光化学染色法检测轴突的损伤和再生修复、成熟少突胶质细胞的新生以及神经生长因子NGF在神经元中的表达等生物学情况。实验结果:1、随着饲喂CPZ饲料时间的延长,C57BL/6J小鼠出现体重减轻的现象,将CPZ饲料撤离后,小鼠体重又恢复到与饲喂常规饲料时小鼠体重无明显差异的水平。但ICA对其体重变化的影响并不显著。饲喂CPZ饲料能够成功诱导C57BL/6J小鼠胼胝体区域出现广泛的髓鞘脱失。在LFB染色下,对照组小鼠在胼胝体区域因为髓鞘完整未受破坏而显蓝色,CPZ模型组小鼠则无法正常着色为蓝染。2、CPZ能够损伤C57BL/6J小鼠胼胝体、额叶皮层区域的髓鞘和轴突,ICA能明显增强再生修复期间的髓鞘、轴突的生长修复作用。免疫组织化学染色结果显示,CPZ诱导小鼠的胼胝体、额叶皮层区域出现MBP含量减低,髓鞘脱失严重的病理改变,这一病理改变在经过1周的髓鞘自我再生修复后并未有所好转,ICA能够明显促进髓鞘再生修复期间髓鞘的生成、重构,且呈剂量依赖性。免疫荧光化学染色结果则显示,在经过5周的CPZ饲料诱导后,NF200阳性的轴突在肼胝体、额叶皮层区域出现明显损伤而丢失,ICA可以逆转其丢失,促进再生修复期间的轴突生长修复。3、CPZ能够诱导C57BL/6J小鼠额叶皮层区域成熟少突胶质细胞(髓鞘生成细胞)的凋亡,ICA能够明显促进再生修复期间成熟少突胶质细胞的新生。本实验发现,以O1ig2和APC共标的成熟少突胶质细胞在CPZ模型组的额叶皮层中大大减少,ICA能够通过促进成熟少突胶质细胞的新生,从而促进髓鞘的再生修复。4、CPZ诱导下的C57BL/6J小鼠额叶皮层神经元表达的神经生长因子锐减,ICA可以增加神经生长因子在额叶皮层神经元中的表达。ICA对髓鞘再生的促进作用可能是通过促进神经元表达神经生长因子实现的。实验结论:动物实验结果显示ICA能够促进再生修复期髓鞘再生和轴突修复。其作用机制可能是通过促进成熟少突胶质细胞的新生和神经营养因子如神经生长因子的生成来实现的。提示ICA可作为治疗包括MS在内的神经退行性疾病的潜在药物,具有进一步开发的价值。