香蕉是世界上最重要的水果之一,被联合国粮农组织定为世界第四大粮食作物。香蕉采后成熟过程中有大量乙烯的产生,并出现呼吸跃变峰,同时引起许多生理生化变化,如淀粉转变为糖、多酚的降解、结构碳水化合物的酶解。这些变化都影响着果实的品质,如硬度,涩味,香味,颜色以及货架期,进而影响到香蕉的商品价值。因此,研究香蕉采后成熟及调控过程对于香蕉品质形成,创新采后保鲜及催熟技术具有重要意义。为在分子水平上深入了解香蕉果实采后成熟的机理,分离香蕉果实采后差异表达基因就成为一种有效的手段。本实验室于2003年采用抑制缩减杂交方法分离了在香蕉采后成熟早期差异表达的低丰度cDNA序列,获得289个重组克隆。BlastX结果表明,有2个734 bp的eDNA片段(编号分别为SSH-169、SSH-287)与其它植物GAD基因相似性较高。对该cDNA片段进行了香蕉果实正常成熟10d(成熟乙烯生物合成启动)和14d(乙烯峰产生)的cDNA微阵列分析,与采后0d的比值分别为5.55和2.75,表明该cDNA序列在这两个时期均为上调表达。并且,在成熟乙烯生物合成启动时该cDNA的表达量是SSH所获得的289个cDNA序列中表达量最高的。所以,该基因可能与香蕉果实采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。在此基础上,采用RACE技术从香蕉果实cDNA文库中分离获得一个全长cDNA,经序列测定和同源性分析表明,该cDNA含1500bp的完整的开放阅读框,编码499个氨基酸残基的GAD蛋白。由于该基因是第一个从香蕉中克隆到的GAD基因,因此将其命名为MaGAD1。序列分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与水稻、柑橘、白杨、番茄等具有较高的一致性(82%、81%、79%、78%),具有与钙调蛋白结合的C端延伸区域和磷酸吡哆醛结合位点。分子进化树分析,表明该基因与番茄的进化关系最近。Southem杂交证明所克隆的GAD基因确实来自香蕉,具有较低的拷贝数。采用RT-PCR的方法对其在香蕉各器官的表达情况分析表明,该基因在香蕉的根、茎、叶、花、果实中均有表达。其中,根、茎、叶、花的表达量较低并且差异不明显,果实中的表达量较高。所以,MaGAD1可能在不同的生理过程中起着一定的作用,而且与果实成熟密切相关。为研究MaGAD1与香蕉采后乙烯生物合成的关系,在正常成熟、乙烯诱导成熟和1-MCP抑制成熟的条件下,测定了香蕉采后不同阶段的乙烯释放量并采用荧光定量PCR的方法研究了MaGAD1在香蕉果实采后不同成熟阶段的表达情况。结果表明,在正常成熟和乙烯诱导成熟的条件下,MaGAD1在成熟乙烯生物合成启动时被显著诱导,其表达量立即达到最大值,并诱导了随后乙烯的大量增加并达到峰值;在1-MCP抑制成熟条件下,内源乙烯的释放量和MaGAD1的相对表达量在香蕉采后成熟不同阶段一直维持在较低的水平。所以,MaGAD1的表达可能既受乙烯诱导又促进乙烯的生物合成,可能与香蕉果实采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。为更深入确切了解该基因在乙烯生物合成和果实成熟中的作用,以采后香蕉果实达到完全成熟(成熟度7)的时间为标准,以MaGAD1转录为依据筛选了香蕉果实采后成熟诱导剂(GABA)和抑制剂(AOAA)。在GABA、AOAA处理及正常成熟条件下,研究了GABA、AOAA对香蕉采后成熟相关生理指标和果实品质的影响,研究了该基因和乙烯生物合成关键酶基因(Ma-ACO1、Ma=ACS1)在香蕉采后不同成熟阶段的表达情况和相互调控关系以及该基因对成熟相关生理变化的调控作用。结果表明:GABA和AOAA分别能诱导和抑制香蕉果实成熟;GABA和AOAA分别能诱导和抑制MaGAD1的表达;MaACS1是香蕉果实采后成熟过程中启动成熟乙烯生物合成的关键酶基因:MaGAD1与MaACS1呈正调控关系调控乙烯生物合成过程,并通过调控采后香蕉果实成熟度、硬度、可溶性总糖和淀粉含量等生理变化调控果实成熟过程;GABA和AOAA通过调控MaGAD1、MaACS1表达及相关生理变化调控果实成熟过程,并且可能不影响果实品质。转基因技术是目前进行基因功能鉴定的有效手段,以pCAMBIA1302载体为基础,将MaGAD1插入到35s启动子下游,GFP基因上游,成功构建了MaGAD1正义反义植物表达载体为后续的转基因鉴定该基因的功能工作奠定了基础。