论文部分内容阅读
柑橘溃疡病是一种危害全球所有商业化柑橘品种的世界性检疫性病害,感染柑橘溃疡病后,将导致柑橘树叶片提前脱落,使柑橘减产,是对柑橘产业最具毁灭性危害的病害之一。目前还未发现完全治愈柑橘溃疡病的方法,生产上通常采用铜制剂抑制柑橘溃疡病菌生长来控制柑橘溃疡病的传播,因此,抗病育种成为辅助柑橘产业抵抗柑橘溃疡病的关键方法。经全球对近百种柑橘种质的筛选,发现了部分耐柑橘溃疡病的种质,但未能得到抗病的资源,本课题组经近十年筛选,获得了对柑橘溃疡病具有稳定抗性的柑橘种质——枸橼C-05,为将其应用到柑橘的抗病育种中,需先探明其对柑橘溃疡病的抗性机制。本研究以抗病种质枸橼C-05为试验材料,不同的感病种质作为对照,筛选与枸橼C-05抗柑橘溃疡病相关的PR4基因,并分析其在枸橼C-05抗病反应中对柑橘溃疡病菌的响应机制。主要研究结论如下:1.通过冰糖橙及枸橼C-05的转录组数据对比分析,发现PR1-1、PR2-1、PR2-3、PR3-1和PR8-2基因可能参与枸橼C-05对Xcc的抗病反应,而PR4-5在枸橼C-05受Xcc侵染后具有特异的上调表达,且在接种Xcc后6 d-12 d一直处于高表达状态,初步判断PR4A基因可能为参与枸橼C-05对柑橘溃疡病的抗病反应的重要基因。2.经在甜橙基因组检索,发现甜橙中存在位于第8号染色体的5个串联的PR4基因,且发现5个PR4蛋白中,PR4-3和PR4-4蛋白含有几丁质结合域,属于PR4蛋白家族中第一类PR4蛋白,而PR4-1、PR4-2和PR4A蛋白不含有几丁质结合域,属于PR4蛋白家族中第二类PR4蛋白;经本课题已完成的转录组测序结果分析,发现PR4A基因在抗病种质枸橼C-05中显著上调;对抗病种质枸橼C-05及感病种质冰糖橙、酸橙和‘早蜜’椪柑接种Xcc,并分析不同种质中各PR4基因对Xcc应答反应,结果表明,在接种Xcc后4 d,感病种质开始表现症状而抗病种质枸橼C-05无症状时,枸橼C-05中PR4A基因的表达量显著高于感病种质的表达量,证明PR4A基因参与枸橼C-05对Xcc的抗病反应。3.对抗病种质枸橼C-05及感病种质冰糖橙、柚、枳和克里曼丁红橘的PR4A核酸序列比对,发现各PR4A基因均含有1个内含子和2个外显子,不同PR4A基因间2个外显子大小相同;经对各PR4A蛋白的氨基酸序列比对,发现枸橼C-05 PR4A蛋白含有2处位于Barwin结构域的特异氨基酸位点(第95号氨基酸:枸橼C-05为T,感病种质为A;第97号氨基酸:枸橼C-05为E,感病种质为Q),与感病种质PR4A蛋白均不同,这两处特异氨基酸位点可能引起枸橼C-05 PR4A蛋白与感病种质PR4A蛋白功能的差异;对各PR4A蛋白进行二级结构及三级结构预测,发现枸橼C-05 PR4A蛋白并无特异的结构区域。4.构建冰糖橙PR4A基因的超表达载体35S::CsPR4A::eYFP及枸橼C-05 PR4A基因的超表达载体35S::CmPR4A::eYFP,在感病种质冰糖橙中进行瞬时超表达,结果显示,CsPR4A及CmPR4A瞬时超表达后在同一时间叶片中单位叶面积的Xcc含量显著低于空载体对照,CmPR4A基因瞬时超表达的叶片中单位叶面积Xcc含量显著低于CsPR4A基因瞬时超表达的叶片中Xcc的含量,说明PR4A基因对Xcc的生长具有抑制作用,而由于对于PR4A基因表达量的验证中,发现CmPR4A基因瞬时超表达的叶片中PR4A基因表达量显著高于CsPR4A基因瞬时超表达的叶片中PR4A基因表达量,因此并不能确认Cm PR4A蛋白与CsPR4A蛋白功能间是否具有差异,还有待进一步验证。