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目前研究表明,疯草类有毒植物的毒性成分-苦马豆素(Swainsonine)主要由三类真菌产生,即豆类丝核菌(Rhizocronia leguminicola)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和棘豆蠕孢菌(Alternaria oxytropis),而有关苦马豆素生物合成通路及催化酶基因尚不清楚。鉴于此,本试验以金龟子绿僵菌为研究对象,通过PEG介导的方法对金龟子绿僵菌合成苦马豆素疑似催化酶基因SwnR进行敲除并验证其功能,旨在探讨SwnR基因在金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路中的作用,为深入研究苦马豆素生物合成通路及相关催化酶基因奠定理论基础。试验结果如下:1.根据GeneBank上的标准序列设计SwnR基因引物,以金龟子绿僵菌cDNA为模板,高保真扩增SwnR基因,PCR产物测序结果与SwnR基因序列BLAST比对同源性为99%。2.以pUC19载体为骨架,通过无缝克隆的方法构建含有苯菌灵抗性基因的金龟子绿僵菌SwnR基因的敲除载体,SwnR上游基因序列和下游基因序列分别连在苯菌灵抗性基因的两端。经PCR和测序鉴定,成功构建载体。3.选用不同发酵时间的金龟子绿僵菌菌丝,在不同的酶解组合及不同酶解时间下对金龟子绿僵菌原生质体的制备条件进行筛选。结果显示,金龟子绿僵菌在CS培养基震荡培养3d,菌丝由1%纤维素酶、1%蜗牛酶和0.5%溶壁酶处理并放置于30℃100rpm孵育3h,原生质体制备效果最佳。4.通过PCR将同源片段进行扩增后,利用PEG转化法将纯化后的片段转化至原生质体。再经苯菌灵筛选获得SwnR基因突变菌株,提取突变菌株DNA并进行PCR验证,SwnR基因敲除菌株构建成功。5.将上述试验获得的突变型与野生型菌株进行发酵培养,经Q Exactive高分辨质谱仪检测野生型与突变型菌株发酵液中苦马豆素的含量分别为119.652μg/mg和11.831μg/mg;采用RT-qPCR技术分析后,发现突变型菌株SwnR基因表达显著下调。本研究成功获得了金龟子绿僵菌SwnR基因敲除菌株,并证明SwnR基因在金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路中起重要调控作用,这为后续SwnR基因在疯草棘豆蠕孢菌苦马豆素合成中的作用及家畜疯草中毒病防控研究提供重要理论参考。