肿瘤是一种发病率与致死率极高的重大疾病,目前,其治疗策略仍以化疗为主。然而,大多数化疗药物在水中的溶解度很低及靶向性差导致的严重不良反应等均严重阻碍了其临床应用。随着近年来纳米递送技术的迅速发展,包括脂质体、高分子药物偶联物、高分子胶束和蛋白质等多种纳米运载工具已被研制出来用于递送疏水性药物。尽管这些工具显著改善了抗肿瘤药物的分散性、生物分布性、药物的生物利用度和靶向性等,但是其相对较低的载药量及大量非活性辅料的使用带来了潜在的安全性风险与高成本。虽然有研究发现通过物理方式获得纯药物的纳米晶体可以大幅度地提高载药量,从而降低非活性辅料带来的风险与昂贵的成本,但这类纳米药物由于稳定性极差,需要额外添加表面活性剂、合成聚合物或生物大分子以防止其进一步生长与团聚,故而仍无法完全摆脱非活性物质的束缚。同时这些纳米药物晶体的结构和形状难以调控,严重限制了其临床应用。因此,构建一种简单、―绿色‖与可控的策略来制备无载体纳米药物,在纳米药物研究领域中仍备受期待。此外,研究提示肿瘤炎症微环境介导的肿瘤免疫逃逸在肿瘤发生中有重要作用,因此肿瘤免疫调节与化疗结合的方式已逐渐成为肿瘤治疗策略中的重要手段。本论文基于非甾体抗炎药物吲哚美辛（Indomethacin,IDM）和化疗药物紫杉醇（Paclitaxel,PTX）分子之间的相互作用力,在不加任何非活性物质的基础上,基于简捷的透析法自组装方案,成功设计与制备了以IDM和PTX分子间作用力为基础的无载体纳米药物——IDM/PTX纳米药物。经超高分辨荧光显微镜、高分辨透射电镜、X射线衍射观察以及计算机模拟其自组装过程,确定该纳米药物中的PTX与IDM分子分别以纳米晶与无晶形式存在,形成类似于―砖块-水泥‖的独特结构。此外,通过调控IDM与PTX的投量比,可以实现该纳米组装体的形貌调控,并发现IDM/PTX投量比在2:1时候会形成微囊结构,能够进一步装载量子点或氧化铁等具有成像能力的无机纳米颗粒,表现出其在成像领域中的应用潜力。由于无晶形式的IDM在血清中能够逐渐溶解,使IDM/PTX纳米药物在血清中逐渐崩解并释放出粒径在100 nm以下的PTX纳米晶体,从而可以依赖滞留效应（Enhanced permeability and retention effect,EPR）导致PTX靶向聚集至肿瘤部位。而IDM作为一种非甾体抗炎药物,能够调节病变部位中的肿瘤相关巨噬细胞由促肿瘤增长的抑炎巨噬细胞转化为抑制肿瘤增长的促炎巨噬细胞,从而激活肿瘤免疫微环境,并帮助化疗药物发挥作用。方法1.基于IDM的PTX无载体纳米药物的构建取1 mL二甲亚砜（DMSO）将不同重量比的IDM和PTX固体溶解于其中,而后采用去离子透析法（1.5 kDa透析袋）将所得到的溶液在2 L超纯水中进行透析（25℃,每2小时换一次超纯水）。透析24小时后,将透析袋中的样品取出进行进一步分析。2.IDM/PTX纳米药物载药量以及包封率的测量与计算取100μL透析所得到的分散液,使用氮吹仪除去溶剂,利用差量法计算得到纳米药物的总质量。随后使用100μL乙腈（HPLC级）溶解所得到的样品,使用高效液相色谱分析仪测定所得到的纳米药物当中的吲哚美辛和紫杉醇的含量。色谱条件为:4.6×150 mm的C8反相柱;流动相A的条件为:45%的0.02%冰醋酸水溶液;流动相B的条件为:55%的乙腈;1毫升/分钟的流速;227 nm的检测波长,分析15分钟。分别得到吲哚美辛m_IDM与紫杉醇的质量m_PTX。3.IDM/PTX纳米药物粒径与表面电位测定将1 m L透析所得到的分散液溶于超纯水制备混悬液,使用马尔文电位粒度仪（Zetasizer Nano,Nano ZS）在25℃,测量角度90°,检测波长633 nm的条件下对混悬液进行测定。4.透射电子显微镜观察IDM/PTX纳米药物的微观形貌将少量的样品的混悬液,滴加至铜网膜上,于室温条件下放置干燥后,采用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）在加速电压80 kV的条件下观察其形态。5.高分辨透射电子显微镜观察IDM/PTX纳米药物晶体结构于碳支持膜上滴加少量样品混悬液,在室温条件下放置干燥后,采用场发射高分辨透射电子显微镜（High-Resolution TEM,HR-TEM）,在加速电压为200 kV,点分辨率为0.24 nm的条件下对样品晶体结构进行观察。6.扫描电子显微镜观察IDM/PTX纳米药物微观形貌于云母片上均匀涂抹少量的样品混悬液,在室温条件下放置干燥,在喷金后再采用扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy,SEM）在15 kV加速电压条件下进行观察。7.激光共聚焦观察IDM/PTX纳米药物荧光性质取少量样品混悬液,稀释后滴加于载玻片上,静置5 min后,按照样品的荧光性质,选择相应的激发与发射波长,采用激光共聚焦（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）观察其荧光性质。8.差示扫描量热仪观测IDM/PTX纳米药物相变情况准确称取IDM、PTX、IDM与PTX混合物以及不同投料比的纳米颗粒样品,分别放置于样品盘中,在氮气的保护下,按照10℃每分钟的升温速度将温度从20℃升至250℃。9.X射线衍射仪观测IDM/PTX纳米药物晶型变化准确称取适量的IDM、PTX、不同投料比的纳米颗粒样品,分别置于X射线衍射仪中在扫描范围,3～60°（2）扫描速度,5°每分钟的条件下进行观测。10.IDM/PTX纳米药物分子间作用力的研究称取适量IDM、PTX、不同投料比的纳米颗粒样品,分别置于紫外分光光度计200nm～800 nm、荧光光谱仪3D扫描模式,250 nm～750 nm与红外光谱仪400～4000 cm^-1中测量光谱信息。11.IDM/PTX纳米药物的体外释放行为研究以2:1(m_IDM:m_PTX)投料比为例来研究纳米颗粒的释放行为。将已知药物总质量的1 m L纳米颗粒混悬液放置于拦截分子量为1 kDa透析袋中,并将两种药物的混合悬浊液做为对照进行试验。将透析袋放置到含有25 m L磷酸缓冲盐溶液（PBS,pH 7.4,0.01 M;吐温80,0.1%）的离心管中,然后在37℃的条件下于恒温摇床中振荡释放。分别于0小时、1小时、2小时、4小时、8小时等时间点各取1 mL释放媒介溶液,在使用氮吹仪移除溶剂后,再用乙腈（HPLC级）100μL溶解,最后利用高效液相色谱分析仪对吲哚美辛和紫杉醇的浓度进行测量。12.计算机模拟IDM/PTX纳米药物形成过程与机制采用分子对接与DPD技术相结合的多尺度模拟策略。采用AutoDock软件（AutoDock 4.2,the Scripps Research Institute）从分子模拟的角度从理论上评价了纳米颗粒当中两种药物分子之间的相互作用能量。然后再利用DPD技术模拟了纳米颗粒的形成过程。采用四川大学分析测试中心提供的Materials Studio 2017软件,计算混合体系当中二元组分之间的Flory-Huggins交互参数。13.细胞吞噬实验在细胞摄取实验中,以1.0×10⁵个/孔的密度,于24孔板中接种人乳腺癌细胞MDA-MB-231。将纳米颗粒和紫杉醇浓度为8.5μg/m L紫杉醇药物加入孔中。分别于培养箱中将细胞培养至2小时、4小时和8小时进行观察。观察前,使用PBS液将细胞洗涤三次,然后将细胞破碎后采用乙腈对药物进行提取。再采用高效液相色谱法测定细胞内的药物含量,并采用BCA法测定总蛋白的含量。结果1.Autodock计算结果表明,IDM与PTX之间存在较强的分子间作用力,主要由由π-π堆叠,氢键以及疏水作用。2.通过IDM与PTX共同透析,在IDM/PTX的投量比为2/1,PTX透析浓度为5mg/m L时,可成功制得平均粒径为461.6±57.72 nm的纳米球。3.IDM/PTX纳米药物的形貌可以通过药物透析浓度与药物投量比进行有效的调控,从而获得线状、网状、蜂窝状、球状、囊泡与膜片状等不同形貌的组装体结构。4.透射电镜与激光共聚焦显微镜结果表明,当IDM/PTX投量比为2/1,PTX初始浓度为10 mg/mL时获的囊泡纳米粒能进一步负载量子点。5.通过差示扫描量热仪、X射线衍射、高分辨透射电镜与小角度X射线散射、高分辨投射电镜、荧光光谱扫描等表征结果,表明IDM与PTX在IDM/PTX纳米药物分别以无晶与纳米晶的形式存在。6.通过紫外分光光度计和傅里叶转换红外光谱仪对IDM/PTX纳米药物的光谱性质进行测定,确定了紫杉醇与吲哚美辛之间的π-π堆叠作用,是IDM/PTX纳米药物中两者之间的主要分子间作用力。7.采用耗散粒子动力学模拟,模拟了IDM/PTX纳米药物的组装过程,模拟结果表明吲哚美辛与紫杉醇组装的早期,紫杉醇因其极强的疏水性率先结晶形成晶核结构,而吲哚美辛则仍处于溶解状态;随着透析过程中,DMSO比例的进一步下降,吲哚美辛分子逐渐吸附于这些紫杉醇晶核表面,阻止了紫杉醇晶体的继续增长,并逐步通过这些吲哚美辛分子将紫杉醇晶核连接形成了各种形态的纳米结构。8.IDM/PTX纳米药物中的吲哚美辛因其无晶形态得到快速的释放,而紫杉醇分子虽然释放速度较紫杉醇的晶体粉末更快一些,但其释放仍相对缓慢。9.IDM/PTX纳米药物在血清中会快速裂解,并释放出粒径大小约为100 nm的纳米颗粒。10.MDA-MB-231细胞对IDM/PTX纳米药物中紫杉醇的摄取效率要远远高于紫杉醇单药的实验组。11.相较于紫杉醇单药,IDM/PTX纳米药物在体外表现出对MDA-MB-231和MCF-7两种肿瘤细胞株更强的抗增殖作用。12.吲哚美辛能有效抑制肿瘤细胞导致的M1型巨噬细胞的CD206的表达上调,在MDA-MB-231细胞与THP-1细胞来源的M1型巨噬细胞共培养体系中,IDM/PTX纳米药物表现出的抗增殖作用明显高于单独的吲哚美辛或紫杉醇。结论本研究首先通过透析法利用IDM和PTX分子之间的特殊相互作用成功制备了具有多种形态的IDM/PTX纳米药物。而后,基于计算机模拟以及相应的实验结果,提出促使IDM/PTX纳米药物形成的分子机制。最后,在初步体外实验中观察到该纳米组装体能够利用IDM调节巨噬细胞表型的作用,较为智能地调节巨噬细胞,使其将免疫治疗与化疗两种治疗策略有机结合起来而获得协同治疗效果,显示了较单独用药更好的抗肿瘤活性。尽管我们所制备的这一纳米药物在功能化、治疗效果和靶向性上依旧存在诸多不足,但与其他依靠运载材料在体内递送的纳米药物相比,IDM/PTX纳米药物因其完全没有辅助材料的参与而显得更加安全。而且,由于该纳米组装体具有可以调整的形态学、完美的药物装载能力以及可作为其他颗粒的纳米载体等特点,提示其具有良好的临床转化前景,有成为一种崭新纳米药物的巨大潜力。此外,这种由另一种活性药物诱导的药物纳米晶组装体也为无载体纳米药物递送系统的设计与开发提供了可借鉴的新思路。