论文部分内容阅读
目的:缺糖缺氧复灌(OGD/R)体外诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤;研究还原型辅酶II(NADPH)对损伤后人脐静脉内皮细胞的保护作用,并观察其对蛋白occludin、MMP9、Bcl-2表达的影响。方法:缺糖缺氧复灌(OGD/R)构造人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型,将实验分为对照组,缺糖缺氧复灌组,缺糖缺氧复灌+NADPH组三个组。实验分三部分进行,第一部分包括细胞增殖试剂盒(CCK8法)检测细胞活力,细胞毒性试剂盒检测细胞内LDH释放,倒置显微镜记录细胞形态,第二部分包括DHE探针检测胞内ROS,比色法检测SOD、MDA,第三部分包括免疫印迹(Western Blot法)检测细胞内MMP9、occludin、Bcl-2蛋白的表达。结果:1.15mmol/L还原型谷胱甘肽可提高HUVECs活力(1±0.05 vs 1.31±0.0.7,P<0.05),高浓度还原型谷胱甘肽可明显提高正常组HUVECs细胞活力(1±0.05 vs1.41±0.09,2.11±028,P<0.05)。低剂量还原型谷胱甘肽对缺糖缺氧复灌损伤HUVECs活力无明显影响,高浓度还原型谷胱甘肽可使HUVECs活力明显上升(0.59±0.0.4 vs1.01±0.12,1.68±0.19,P<0.05)。2.大剂量的a硫辛酸可降低正常对照组HUVECs的细胞活力(0.89±0.06,vs 0.72±0.07,0.74±0.07,0.65±0.04,0.54±0.06,P<0.05),各浓度a硫辛酸对缺糖缺氧复灌组HUVECs细胞活力无明显影响(0.52±0.08 vs 0.46±0.04,0.48±0.06,0.47±0.04,0.49±0.06,0.51±0.04,0.56±0.05,0.58±0.08,0.60±0.03,P>0.05)3.不同浓度NADPH对正常HUVECs活力无影响(OD值1.02±0.08 vs1.06±0.09,1.14±0.10,1.12±0.15,1.12±0.12,1.01±0.08,P>0.05),缺糖缺氧复灌处理后HUVECs活力明显降低(OD值0.51±0.07 vs 1.02±0.08,P<0.05),NADPH可剂量依赖性增加HUVECs活力(OD值0.51±0.07 vs 0.53±0.05,0.58±0.07,0.62±0.04,0.68±0.03 0.68±0.09,P<0.05)。NADPH有效药物浓度低,使用剂量小,效果优于还原型谷胱甘肽及a硫辛酸。4.NADPH可剂量依赖性降低正常HUVECs中LDH释放(抑制百分率(100±11.99)%vs(95.30±5.96)%,(81.94±10.22)%,(80.39±4.96)%,(72.05±7.98)%,(69.83±8.20)%,P<0.05),缺血缺氧处理后HUVECs中LDH释放明显增加((100±11.99)%vs(201.34±15.14)%,P<0.05),NADPH可剂量依赖性降低细胞内LDH释放((201.34±15.14)%vs(186.98±16.38)%,(187.23±18.56)%,(176.15±12.17)%,(154.78±12.97)%,(158.46±8.25)%,P<0.05)。5.缺糖缺氧复灌使HUVECs皱缩,触角伸出,颗粒物增加,NADPH可促进缺血缺氧损伤后HUVECs细胞形态的恢复。6.缺糖缺氧复灌损伤后胞内ROS含量明显增加,予NADPH处理后胞内ROS明显降低。7.缺糖缺氧复灌后HUVECs中SOD活力降低(8.29±0.71U/mg pro vs 4.88±0.69U/mg pro,P<0.05),NADPH可促进胞内SOD活力恢复(4.88±0.69 U/mg pro vs6.97±0.46 U/mg pro,P<0.05)。缺糖缺氧复灌后HUVECs中MDA增加(11.11±1.22ug/mg pro vs 26.73±2.54 ug/mg pro,P<0.05),NADPH可减少HUVECs中MDA(26.73±2.54 ug/mg pro vs 13.32±2.04 ug/mg pro,P<0.05)。8.缺糖缺氧复灌后HUVECs中MMP9蛋白表达上调,NADPH处理后可抑制MMP9蛋白上调;缺糖缺氧复灌后HUVECs中occludin蛋白表达明显被抑制,NADPH处理后可促进occludin蛋白的恢复。9.缺糖缺氧复灌后HUVECs中Bcl-2蛋白明显下调,给予NADPH处理后Bcl-2蛋白的下调被抑制。结论:1.NADPH对缺糖缺氧复灌损伤后HUVECs具有保护作用;2.NADPH对HUVECs的保护作用优于还原型谷胱甘肽及a硫辛酸;3.NADPH发挥HUVECs保护作用与抑制损伤后HUVECs内氧化应激反应有关;4.NADPH发挥HUVECs保护作用可能与上调occludin蛋白,抑制MMP9蛋白表达有关,保护紧密连接结构有关;5.NADPH发挥保护作用的机制可能与抗凋亡有关。