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[目的] 应用生物信息学工具和实验室方法对鼠疫耶尔森氏菌6KB(PYC)质粒的全基因组序列进行初步分析并对其来源、基因组编码的功能进行预测。
[方法] 通过美国国立图书馆网站序列比对搜索工具(BLAST)对鼠疫菌PYC质粒全序列进行核酸与核酸、蛋白与蛋白比对研究。然后应用生物信息学工具对鼠疫菌PYC质粒的全基因组序列进行初步分析,并对其基因和外显子区域进行预测,研究其中两个区域的蛋白质结构域和功能。同时对鼠疫菌PYC质粒的密码子偏好进行分析。最后应用斑点杂交的方法,将整个PYC质粒设计为探针,随机抽取鼠疫近缘菌的肠杆科细菌40余种,对他们全部的DNA进行斑点杂交。
[结果] BLAST比对发现鼠疫菌PYC质粒部分基因与宋内志贺氏菌质粒pKYM,伤寒沙门菌基因LT2和pIMVS1,大肠埃希菌0157:H7、 K—12、ECOR31株局部基因和编码蛋白具有同源性,核酸序列一致性达到89%。序列分析发现该质粒含有两个基因区,第一个基因区可能编码着一个毒素和反毒素系统RelB&RelE。第二个基因区可能编码着一个复制子RepB、结连转移蛋白VirB6、四型分泌系统T4SS。密码予偏好分析发现古老型鼠疫菌的三个质粒中PMT1和PCD1质粒的密码子相似,而与PCP1存有一定的差异,这三者与云南PYC质粒的密码子偏好差异较大,密码子使用频率RSCU值存在差异。斑点杂交结果显示,对随机抽取的近40余种鼠疫近缘菌全部的DNA进行斑点杂交的结果均为阴性。
[结论] BLAST的比对分析认为PYC质粒的来源和功能可能与肠杆菌属细菌相关。序列分析发现RepB可能与质粒复制有关。VirB在细菌表面起作用,他指导着大分子进入细胞,是Ⅳ分泌系统组成的必需元件。T4SS结构域家族成员是Ⅳ分泌系统组成元件,他们通过一种原始的细菌结合机制调节大分子在细胞内的转移。RelB和RelE构成一个毒素和抗毒素系统,RelE通过和核糖体的结合阻止蛋白质的翻译,而RelB和RelE结合解除了阻止过程,这一对系统对质粒的存在起稳定性的作用。密码子偏好分析认为鼠疫菌在获得PCP1和PYC质粒的时间可能要比PMT1晚或者说鼠疫菌与PMT1的亲缘性要比PCP1和PYC质粒的近。而PYC质粒有可能是最近才获得的。斑点杂交发现该质粒只存在于某些鼠疫菌中,说明该质粒不是从这些鼠疫菌近缘菌(肠杆科属菌)获得的,可能是通过质粒转移等方式从其他外界获得的。综合以上的初步分析,PYC质粒具有与质粒复制与分配相关的基因,可能作为一个相对独立的遗传元件在不同的细菌问传递,PYC质粒很有可能是通过基因水平转移过程由其它细菌传递到鼠疫菌中的,所以有关该质粒的来源还须做进一步研究。