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研究背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,目前已成为慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)、终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)最常见的原因。由于DN的发病机制复杂且尚未完全明了,迄今有针对性的有效预防及治疗方案疗效均不理想。因此继续深入地探讨DN的发病机制,以寻找有效防治措施,成为现阶段的研究热点。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)属于受体酪氨酸激酶Er B家族成员之一。研究证实EGFR活化与TGFβ信号通路相互作用是肾组织纤维化的重要环节,并在糖尿病肾损伤的发生、发展过程中发挥了重要的作用。厄洛替尼(erlotinib)作为一种口服的新型表皮生长因子受体抑制剂,通过与酪氨酸激酶催化区结合位点竞争性地结合,阻断EGFR酪氨酸激酶的信号传导途径,阻止纤或延缓维化的发生,从而可能起到发挥保护肾脏的作用。实验目的本研究通过对糖尿病肾病大鼠模型进行厄洛替尼干预,从生化指标、肾脏病理水平来证实其对糖尿病肾病大鼠模型有无肾脏的保护作用;并研究厄洛替尼发挥保护作用的分子机制,以初步探讨厄洛替尼治疗糖尿病肾病的临床应用价值。实验方法1糖尿病肾病模型构建将18只成年雄性SD大鼠(200±20g)以随机的方式分为:(1)正常对照组;(2)模型组;(3)厄洛替尼组,每组6只。对照组:正常饲料喂养,不作特殊处理。模型组:予注射STZ溶液,大剂量(60 mg/kg)一次性腹腔注射;厄洛替尼组:腹腔注射STZ溶液(60mg/Kg),造模4周后予厄洛替尼溶液(10 mg/kg),按1 ml/100 g灌胃,连续4周。模型组同期给予同等容积的生理盐水。2取材大鼠予以腹腔注射7%水合氯醛(0.5ml/100g),达到满意麻醉后,将大鼠以仰卧位固定于清洁操作台,腹部皮肤消毒,沿腹侧正中线自阴茎上缘由下而上剪开腹部皮肤直至剑突,暴露腹腔,在腹膜外腰部脊柱两侧寻找到并取下双侧肾脏,仔细清理肾周筋膜组织,用生理盐水将血迹洗净。将取出的组织保存在装有4ml 4%多聚甲醛的5ml EP管里,4℃保存,做HE检测、Masson染色和免疫检测。3检测指标3.1血糖仪检测各组动物血糖浓度变化;3.2试剂盒检测24h尿蛋白定量;3.3试剂盒检测血肌酐含量;3.4 HE染色检测各组模型动物肾脏病理情况;3.5 Masson染色检测各组模型动物肾脏纤维化;3.6免疫组化检测每组模型动物肾脏组织纤维化相关蛋白;3.7 Western blot检测相关信号通路的改变;3.8检测大鼠肾组织中的氧化应激水平。实验结果1.厄洛替尼对STZ诱导大鼠糖尿病肾病模型血糖的影响第6周和第8周对照组空腹血糖值分别为6.88±0.37 mmol/L和6.86±0.23 mmol/L,模型组的空腹血糖值分别为19.23±2.35 mmol/L和19.43±1.99 mmol/L,厄洛替尼组空腹血糖值分别为13.2±2.07mmol/L和9.97±3.09 mmol/L。模型组空腹血糖水平在第6周和第8周均显著高于对照组(P<0.01);而厄洛替尼组空腹血糖水平与模型组相比明显下降(P<0.01)。2.厄洛替尼对STZ诱导大鼠糖尿病肾病模型尿蛋白和血清肌酐的影响第6周和第8周对照组24 h尿蛋白含量分别为5.27±1.33 mg和5.33±1.35 mg,模型组24 h尿蛋白水平分别为23.10±5.20 mg和22.88±6.10 mg,厄洛替尼组尿蛋白水平分别为15.78±1.83 mg和8.38±1.67mg。与对照组相较,在第6周和第8周,模型组尿蛋白水平明显升高(P<0.01);与模型组相较,厄洛替尼组尿蛋白水平显著下降(P<0.01)。在第6周和第8周对照组血清肌酐水平分别为77.32±10.99μmol/L和76.61±8.78μmol/L,模型组血清肌酐水平分别为208.02±35.85μmol/L和213.87±55.42μmol/L,厄洛替尼组血清肌酐水平分别为168.21±13.80μmol/L和138.86±16.53μmol/L。模型组血肌酐值较对照组高,两组之间的差异存在统计学意义(P<0.01);而厄洛替尼组血清肌酐相较模型组下降(P<0.05)。3.厄洛替尼对STZ诱导大鼠糖尿病肾病模型肾脏组织病理学变化的影响HE染色显示:对照组肾小球形态正常、结构清晰,上皮细胞排列整齐,小管间质、肾血管未见异常。模型组大鼠肾小球系膜细胞增生,上皮细胞结构、排列紊乱,基底膜增厚。厄洛替尼组与模型组对比显示大鼠肾脏病理改变程度有明显减轻。Masson染色显示:对照组仅可看到轻微少量的蓝染,模型组可看到大量蓝色深染的胶原纤维,相较对照组明显增多,厄洛替尼组与模型组对比显示胶原纤维沉积程度明显减轻。4.厄洛替尼对糖尿病肾病肾组织中IV型胶原表达的影响对照组中IV型胶原表现为低表达,而模型组大鼠肾组织中IV型胶原表达较前者显著升高。给予厄洛替尼后,IV型胶原表达较模型组显著下降。5.厄洛替尼对糖尿病肾病肾组织中EGFR及p-EGFR蛋白表达水平的影响各组间EGFR的表达水平无明显差别。模型组与对照组相比肾组织中p-EGFR的表达水平明显升高。厄洛替尼组与模型组相比,其肾组织中p-EGFR表达水平明显下降。6.厄洛替尼对糖尿病肾病肾组织中TGFβ信号通路的影响模型组与对照组相比,其肾组织中TGFβ1、p-Smad2/3、Ⅳ型胶原和纤连蛋白的表达程度明显上升。厄洛替尼组与模型组相比,其肾组织中TGFβ1、p-Smad2/3、Ⅳ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达程度显著降低。7.厄洛替尼对糖尿病肾病肾组织中氧化应激水平的影响相比较于对照组,模型组肾组织中ROS明显升高(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01),相比于模型组,厄洛替尼组大鼠肾组织中ROS水平有明显降低(P<0.01),MDA水平亦有降低(P<0.05)。结论1.EGFR抑制剂厄洛替尼能够改善糖尿病肾病大鼠血糖及24 h尿蛋白水平,改善肾组织的病理损伤。2.厄洛替尼能够减轻模型大鼠肾脏纤维化水平。3.厄洛替尼改善糖尿病肾病的分子用机制可能与抑制糖尿病肾病肾组织中EGFR/TGFβ–Smad2/3信号通路的激活,减弱肾组织的纤维化和氧化应激反应有关。