巴斯德毕赤酵母表达系统是一种成熟高效的真核表达系统,目前在毕赤酵母系统里已有500多种蛋白成功地进行表达。工业用脂肪酶的重要来源之一是微生物脂肪酶,本实验室筛选到的一株产脂肪酶的米曲霉菌株WZ007,其脂肪酶基因aol已成功在大肠杆菌表达系统进行表达,酶活性不高,因此本课题将利用巴斯德毕赤酵母表达系统对aol基因进行胞外分泌表达,获得高酶活脂肪酶,并对其催化应用进行研究,研究结果如下:1、实验成功构建毕赤酵母X-33/αA-aol工程菌。将含有aol目的基因的pPICZαA诱导型表达载体电穿孔转化P.pastoris X-33感受态细胞,筛选阳性转化子X-33/αA-aol工程菌。阳性重组子在30℃经甲醇诱导培养4 d,离心取上清测得粗酶液脂肪酶活力为341 U/mL。SDS-PAGE分析表明在目标分子量28 kDa左右有明显条带。2、通过采用结合抗性梯度筛选和罗丹明B平板筛选方法,筛选到转化子58#菌株,其发酵酶活力最高,初始酶活力达341 U/mL,并对该菌株的发酵条件在摇瓶的水平上进行优化。优化后的发酵条件为培养基初始pH 7.0,摇瓶装液量为50 mL（500 mL锥形瓶）,甲醇诱导192 h,每24 h甲醇添加量2.0%,诱导温度为28℃时,酶活力达到793U/mL,是初始酶活力的2.34倍。对工程菌采用补料分批培养的方式进行5 L发酵罐放大培养,在整个发酵过程中,细胞干重达到311 g/L,发酵液酶活力最高为4240 U/mL,蛋白表达浓度为15.21 mg/mL,发酵液中的AOL比酶活在发酵84 h达到最大值432 U/mg。3、对重组脂肪酶AOL进行分离纯化研究。发酵上清液经超滤浓缩,阴离子交换层析和疏水作用层析纯化后,酶液体积为100μL,蛋白浓度为7.50 mg/mL,总蛋白量为0.75 mg,总酶活为4153.99 U,比酶活为5509.27 U/mg。纯化倍数达到72.33倍,但酶活的回收率较低,仅为3.77%。从SDS-PAGE图中看到单一条带,表明目的蛋白成功分离纯化达到电泳纯。4、对重组脂肪酶AOL的酶学性质进行研究。研究表明该酶的最适pH为8.0,酶在pH 7.5-9.0范围内有较高的活性。该酶的最适温度为40℃,在30-50℃温度条件下,具有较好的热稳定性。V_max为6841.98U/mg,K_m为1.23 mM。该酶对碳链长度（C2-C18）三酰基甘油酯底物都具有一定的水解活性,其中对三丁酸甘油酯的水解活力最高。在金属离子添加浓度为1 mM时,AOL的酶活力都会受到抑制作用,其中Cu²⁺和Zn²⁺金属离子的抑制效果最明显。当金属离子浓度为5 mM时,Zn²⁺几乎完全抑制该脂肪酶的活性,活力低于原酶活力的20%。其中Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺等金属离子对脂肪酶均无明显激活作用和抑制作用。5、利用共价结合法将重组脂肪酶AOL制备成固定化酶,并应用于手性化合物R,S-苯氧丙酸甲酯拆分反应中。优化后的酶固定化工艺如下:经终浓度为0.25%的戊二醛活化的伯氨基树脂与酶蛋白比例为1:0.2（g/mg）,酶液浓度是0.04 mg/mL,1 g树脂对应的酶液体积为5 mL,150 rpm、30℃水浴摇床吸附1 h后,加入去离子水洗涤固定化酶两次,过滤得到固定化脂肪,固定化酶K_m和V_max分别为1.97 mM和4839.35U/mg。制备的固定化酶重复使用15次后仍保持85%以上的相对活性。固定化酶拆分R,S-苯氧丙酸甲酯反应的最佳条件如下:在0.2 mol/L pH7.5磷酸钠缓冲液中,底物浓度0.5 mol/L时,水浴摇床30℃、200 rpm条件下反应160 min时,催化反应底物转化率达50%,底物的对映体过量值e.e._s达到97.2%。