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人表皮生长因子(hEGF)于1975年由Cohen等和Gregory各自独立地从人尿液中分离得到,是由53个氨基酸组成的小分子多肽,含有3个链内二硫键,结构稳定。研究表明,hEGF具有多种生物学功能,它通过与细胞膜上hEGF受体结合,促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应而发挥生理作用,如它可促进细胞分裂,修复皮肤创伤、胃肠溃疡、角膜损伤等;防止皮肤衰老,起到美白嫩肤的作用;靶向性结合含高密度hEGF受体的肿瘤组织等。商品化的hEGF具有很高的市场价值,且市场需求量大,提高其表达量及生物学活性可广泛用于临床,满足市场的需要。本研究利用毕赤氏酵母P. pastoris表达系统对hegf基因进行了表达研究和高效表达菌株筛选。主要工作及结果包括:(1)利用套叠PCR合成获得hegf基因,并通过克隆、测序验证了hegf序列,其大小为159bp;(2)在构建了pGAPZα-hegf表达载体基础上,利用同裂酶AvaⅢ和PstⅠ构建3种多拷贝表达载体,分别为pGAPZα-2hegf(318bp)、pGAPZα-3hegf(477bp)和pGAPZα-4hegf(636bp),并在各拷贝间引入kex2蛋白酶切位点,以便在毕赤氏酵母中表达时切割形成单个hEGF分子; (3)利用化学法和电激法转化技术、Zeocin抗生素筛选、PCR鉴定和SDS-PAGE分析获得了pGAPZα-hegf/GS115、pGAPZα-2hegf/GS115、pGAPZα-3hegf/GS115和pGAPZα-4hegf/GS115四种酵母工程菌株;(4)通过比较研究,确定了尿素-SDS-PAGE凝胶体系和Tris-Tricine缓冲体系比较适合小分子多肽电泳;(5)利用SDS-PAGE进行高表达菌株的筛选,获得各种拷贝的高表达重组酵母菌株各1株,表达量分别达25.2mg/l、28.6mg/l、38.9mg/l和26.0mg/l,占分泌蛋白量约35%-40%,其中以pGAPZα-3hegf/GS115表达量为最高;(6)对重组蛋白进行了初步纯化及活性分析。利用Western blot分析重组蛋白免疫原性,结果表明重组蛋白具有与天然hEGF相同的免疫原性;利用MTT法检测工程菌株发酵产物的生物活性,结果表明经表达的重组蛋白具有促进Balb-3T3细胞增殖的作用。以上这些研究不仅为小分子肽的基因工程药物研发奠定理论基础,而且为hEGF的研发及临床应用打下良好的基础,具有重要理论与实践意义。