本实验通过自行设计建立不停跳心脏移植模型(持续氧合血灌注、不停跳保存供心)以及改良Heron法建立停跳心脏移植模型(低温高钾停跳液保存供心),研究不停跳心脏移植(避免缺血再灌注损伤模型)相对于停跳心脏移植(缺血再灌注损伤模型),在供心保存、移植心脏免疫原性、移植心脏血管病等方面的影响和意义,为促进器官移植理论及实践的发展提供科学依据。研究结果表明,不停跳心脏移植,由于避免了缺血再灌注损伤,抑制了心肌细胞凋亡的发生,因此提高了供心保存质量;由于减轻移植心脏MHCⅡ、B7-2 mRNA的表达及阻止移植心脏B7-1 mRNA及其蛋白表达,因此明显减轻了移植心脏的免疫原性,有助于延缓或减轻急性排斥反应的发生;由于更好地保护移植心脏血管内皮细胞功能、eNOS径路以及NO分泌水平,因此在预防移植心脏血管病方面起到重要作用。与此相反,心脏停跳移植,由于难以避免缺血再灌注损伤,移植心脏心肌细胞凋亡率高、免疫原性明显增强、移植心脏血管病变明显并呈加速性进展。第一章同种异位不停跳心脏移植模型的建立目的:建立不停跳心脏移植模型,以便于与传统供心保存方法对比,研究持续氧合血灌注、不停跳保存供心(避免缺血再灌注损伤)对移植心脏各方面的影响。方法:采用活鼠替代体外循环机,经活鼠下腔静脉输血,腹主动脉氧合血灌注给供体心脏,维持供心有节律地跳动,并用双血管套管连接法把供心移植给受体,从而建立大鼠颈部不停跳心脏移植模型。结果:连续正式试验53次,移植成功50次,手术成功率94.3%。每例手术总时间90～120 min,其中,受体颈部血管套管准备(18±3)min,供心摘取(33±5)min,颈部移植(8±1)min,体外灌注(15±2)min。结论:活鼠替代体外循环机模型辅助下,能够常规建立大鼠颈部不停跳心脏移植模型,不需要体外循环机,无需显微外科操作,是一种无缺血再灌注损伤、经济可靠、易于复制、新的器官移植研究动物模型。第二章改良Heron法建立同种异位停跳心脏移植模型目的:对Heron法建立心脏移植模型的手术方法进行改良,建立更合理、符合实验需要的心脏移植模型。方法:对Heron法进行改良,将受体右颈外静脉套管插入供心右肺动脉,右颈总动脉套管插入供心主动脉,环扎固定,供心左肺动脉结扎,从而建立改良的大鼠颈部心脏移植模型。结果:单人操作连续进行正式试验52次,移植成功50次,成功率96.2%。全组受体无手术死亡,无吻合口漏血、血液回流障碍。每例手术总时间需50～60 min;受体血管套管准备时间为(18±3)min;供心摘取时间为(10±1)min;颈部移植时间为(6±1)min;冷缺血时间为(16±1)min。结论:改良Heron法建立大鼠颈部心脏移植模型,无需显微外科操作,是一种更合理、实用、稳定可靠和易于复制的器官移植研究动物模型。第三章持续氧合血灌注、不停跳保存供心对移植心脏心肌细胞凋亡的影响目的:研究持续氧合血灌注、不停跳保存供心对移植心脏心肌细胞凋亡的影响。方法:随机分成3组:对照组(无心脏移植)、不停跳组、停跳组;术后分别3、7天采集标本;黄嘌呤氧化酶法检测血清T-SOD活力,硫代巴比妥酸法检测血清MDA水平;免疫组织化学法测定Bcl-2及Bax蛋白表达水平;TUNEL法检测移植心脏原位细胞凋亡情况;透射电镜观察移植心脏超微结构变化。结果:心脏移植后,停跳组血清MDA水平显著高于对照组(P<0.05)(峰值在移植后3天),T-SOD水平显著低于对照组(P<0.05)(谷值在移植后3天),不停跳组血清MDA、T-SOD水平与对照组比较改变轻微,无显著性意义(P>0.05);心脏移植后3天,停跳组心肌组织中Bcl-2/Bax比值显著低于不停跳组及对照组(P<0.05);对照组、不停跳组、停跳组心肌细胞凋亡指数分别为0.54±0.12、0.73±0.17、4.92±0.40,停跳组心肌细胞凋亡指数明显高于不停跳组、对照组(P<0.05),不停跳组与对照组比较无显著性意义(P>0.05);不停跳组心肌超微结构改变轻微,而停跳组超微结构改变明显。结论:持续氧合血灌注、不停跳保存供心方法,使不停跳组移植心脏避免了缺血再灌注损伤,保护了抗凋亡因子(如Bcl-2),减轻了促凋亡因子(如Bax)的产生,从而抑制心肌细胞凋亡的发生,取得了良好的供心保存效果。同时也进一步证明了不停跳心脏移植模型的可行性。第四章持续氧合血灌注、不停跳保存供心对移植心脏免疫原性的影响目的:研究持续氧合血灌注、不停跳保存供心对移植心脏免疫原性的影响。方法:随机分成3组:对照组(无心脏移植)、不停跳组、停跳组;术后7天采集标本;Real-Time PCR检测移植心脏MHCⅡ、B7-2 mRNA表达水平;Reverse-Transcription PCR、Western blotting分别检测移植心脏B7-1 mRNA、B7-1蛋白表达情况。结果:心脏移植后7天,对照组正常心脏构成性表达MHCⅡ、B7-2 mRNA,在对照组、不停跳组、停跳组移植心脏心肌组织中,MHCⅡmRNA的表达相对强度分别为:1.36±0.26、1.48±0.31、9.29±0.53,B7-2 mRNA的表达相对强度分别为:1.37±0.24、1.46±0.30、5.45±0.43;停跳组MHCⅡ、B7-2 mRNA表达水平显著高于不停跳组、对照组(P<0.05),而不停跳组与对照组比较无显著性意义(P>0.05)。对照组正常心脏及不停跳组移植心脏心肌组织中未见B7-1 mRNA及蛋白表达,而停跳组移植心脏见B7-1 mRNA及蛋白表达。结论:缺血再灌注损伤确实能增强移植心脏免疫原性,持续氧合血灌注、不停跳保存供心,由于避免了缺血再灌注损伤,从而减轻了移植心脏的免疫原性,有利于减轻或延缓急性排斥反应。第五章持续氧合血灌注、不停跳保存供心对移植心脏血管病的影响目的:研究持续氧合血灌注、不停跳保存供心对移植心脏血管病的影响。方法:随机分成3组:对照组(无心脏移植)、不停跳组、停跳组;术后120天采集标本;硝酸还原酶法测定血清的NO水平;Reverse-Transcription PCR检测移植心脏eNOS、iNOS mRNA表达水平;HE染色、Elastin-Van Gieson染色,光学显微镜观察移植心脏冠脉血管病变情况并评分。结果:心脏移植后120天,对照组、不停跳组、停跳组移植心脏冠状动脉内膜eNOS mRNA的表达相对强度分别为:0.98±0.10、0.84±0.11、0.25±0.07,停跳组比不停跳组降低更显著(P<0.05);对照组正常心脏及不停跳组移植心脏未见iNOS mRNA表达,而停跳组表达阳性;不停跳组、停跳组血清NO水平分别为:98.70±14.30μmol/L、78.38±10.96μmol/L,停跳组明显低于不停跳组(P<0.05);对照组、不停跳组、停跳组CAV评分分别为:0、0.72±0.21、2.75±0.28分,停跳组CAV评分明显高于不停跳组(P<0.05)。结论:缺血再灌注损伤造成移植心脏血管内皮损伤、功能失调,导致eNOS分泌路径紊乱,NO生成减少,最终导致CAV病变;持续氧合血灌注、不停跳保存供心,由于避免了缺血再灌注损伤,从而减轻了移植心脏血管内皮损伤,保护了血管内皮功能及NO的正常分泌,从而有利于预防CAV。