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生物柴油作为石化燃料的替代能源,已在国际上得到了广泛的应用。利用基因工程技术获得高油脂微藻,是当今国际上开发生物柴油的有前景的方向之一。蓝藻作为一种简单的原核光合生物,生长迅速,油脂含量较高；同时适应性强,便于遗传操作,通过基因工程改造适合作为生物柴油的原料。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸代谢中的关键酶,在生物体内催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A的反应,这是脂肪酸从头合成的第一步也是限速步骤。本研究主要包括整合表达载体的构建和微藻ACCase的生物信息学分析两部分。(一)成功构建了蓝藻pAnFP整合表达载体,并克隆了鱼腥藻7120(Anabaena sp. PCC7120)编码乙酰辅酶A羧化酶CT-β亚基的accD基因。构建的蓝藻pAnFP整合表达载体包括整合片段F(有两个侧翼的整合片段F1和F2),启动子PpsbA1,以及带有自己启动子的新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ。利用PCR扩增技术,从鱼腥藻7120基因组DNA获得两个整合片段Fl和F2以及启动子PpsbA1,新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ来自原核表达载体pET30。accD基因克隆到载体pBS-T上,经DNA序列测定确定此基因即为鱼腥藻7120ACCase CT-β功能域基因。(二)采用生物信息学的方法对不同蓝藻ACCase的各亚基的理化性质、信号肽、跨膜区、疏水性／亲水性、蛋白质二、三级结构等进行了生物信息分析与预测,并构建不同物种ACCase各亚基的系统进化树。蓝藻ACCase的BC亚基和BCCP亚基是不稳定蛋白,并且没有明显的卷曲结构；CT-α亚基和CT-β亚基为稳定蛋白,具有明显的卷曲结构；四个亚基均无信号肽和跨膜结构区,BC亚基的保守结构域最多有7个；二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,零星散布着少量的延伸链。在ACCase进化关系上,不同亚基的系统进化关系有一定差异性,但总的来说类似于相近物种的亲缘关系也相近,原核蓝藻ACCase之间进化距离最近,表明其进化途径非常稳定,是由同一个祖先共同进化而来的；其次是原核蓝藻与真核藻和油料植物关系较近,表明它们来自于一个进化关系较近的祖先物种；微藻与高等动物、酵母菌的进化距离最远,表明其亲缘关系较远,很早就与其他物种分开进化。