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目的:通过对原始菌株NK703进行定点突变,筛选出具有对底物特异性高和高催化活性的α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(AKA-7-ACA)酰化酶产生菌。对AKA-7-ACA酰化酶进行高水平表达、固定化及酶学研究,以获得一个具有高催化活性的AKA-7-ACA酰化酶制剂,结合D-氨基酸氧化酶(DAAO)和过氧化氢酶(CAT),三酶系统一步法催化头孢菌素C(CPC)生产7-ACA。高催化活力AKA-7-ACA酰化酶产生菌的获得,可能会对现行的7-ACA酶法工艺产生重大变革,使生产7-ACA变得更简单、经济与环保。方法:1.对野生假单胞菌来源的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GA)基因与酶蛋白质纯化、测序,酶3D结构建模,与BRENDA、PDB数据库资料进行对比分析,确定酶活性中心关键氨基酸,分析突变位点对酶催化活力的影响。2.以假单胞菌来源的GA核苷酸为模板,设计不同的上游引物,进行易错PCR介导的体外基因扩增,控制PCR反应体系条件,以获得最佳突变频率的基因多样性文库。在含卡那霉素的LB培养基进行初筛,获得阳性克隆。3.对酶的发酵工艺和提取方式优化,酶蛋白分离纯化、酶分子固定化与稳定性研究。4.分别对单酶系统一步法、双酶系统一步法、三酶系统一步法催化CPC生产7-ACA进行研究,分析各酶法的得率及工艺的优缺点。结果:1.确定野生菌Pseudomonas species NK703酶活性中心氨基酸序列与基因序列特点。2.利用同源建模,确定突变位点分别为N21βM、N21βQ、P22βF、P22βN、P22βY、H23βF、H23βR、T69βL、T69βN、V70βF、V70βL、N244βM、N244βQ、K374βR、K374βE、S377βM和S377βY并进行定点突变获得相应菌株。其中由4株突变菌株V70βL、K374βR、S377βY和S377βM所产生的GA酶活力比原始菌株升高;由6株突变菌株V70βL、V70βF、K374βR、K374βE、S377βY和S377βM所产生的AKA-7-ACA酰化酶酶活力比原始菌株升高。以GL-7-ACA为底物测定Km时,发现4株突变菌株V70βL、V70βF、K374βE和S377βY的Km值比原始菌株NK703的Km值变小;以AKA-7-ACA为底物测定Km时,发现5株突变菌株V70βL、V70βF、K374βR、K374βE和S377βY的Km值比原始菌株NK703的Km值变小。3.使用3%(w/v)乳糖作为诱导剂,摇瓶诱导发酵重组菌NK703获得的GA和CAT活力达到最高,分别为2800.12 U/L和124.28 U/L,比使用IPTG诱导表达产生的最大酶活分别增加了2.9倍和1.3倍。通过流加补料策略,5 L发酵罐诱导发酵60 h,菌体含量达到最高为35.21 g/L,而诱导发酵72 h,重组菌的酶活力达到最高,GA为7099.85U/L和CAT为15776.20 U/L;与摇瓶发酵相比,菌体含量提高了4.3倍,GA酶活提高了5.3倍和CAT酶活提高了8.5倍。4.利用功能化氧化石墨烯为固定化载体,对固定化的工艺进行优化。在最佳的固定化条件下,固定化溶液体系的p H值为7和酶/载体比为15 mg/g,在35℃固定60 min,固定化率和酶活回收率分别为86%和52%。固定化GA热稳定性比游离酶的热稳定性提高1.7倍。游离和固定化GA的Km分别为1.07 m M和3.15 m M,Vmax分别为6.76μmol/min和5.61μmol/min。固定化酶Km的增加表明固定化GA的亲和力低于游离酶。5.对不同的酶系统一步法制备7-ACA进行研究,在同样条件下,单酶系统一步法、双酶系统一步法和三酶系统一步法制备7-ACA的得率分别为54.80%、80.50%和87.28%。三酶系统一步法制备的7-ACA得率最高。结论:1.获得正确的目标菌株NK703及定点突变的各突变菌株,6株突变菌株发生正突变。2.发酵罐高密度发酵表达NK703,经优化提取后的GA最高酶活达7099.85 U/L和CAT为15776.20 U/L,可用作酶法制备7-ACA。3.经功能化氧化石墨烯载体固定化GA,其固定化率和酶活回收率分别为86%和52%;Km为3.15 m M,亲和力低于游离酶。4.三酶系统一步法工艺制备7-ACA的得率最高。