【摘 要】
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B淋巴细胞刺激因子(BLyS)是1999年发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族的一个新成员，主要调节B细胞的增殖、分化，BLyS表达异常会引起严重的免疫功能紊乱。本研究首先在大肠杆菌中对BLyS进行了可溶表达，获得了有活性的表达产物，以BLyS为靶蛋白对噬菌体随机12肽库进行亲和淘洗，筛选到一结合肽；其次将该肽与BLyS受体-B细胞成熟抗原(BCMA)胞外区序列比较，确定位点对BCMA进行了定点突变，
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B淋巴细胞刺激因子(BLyS)是1999年发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族的一个新成员，主要调节B细胞的增殖、分化，BLyS表达异常会引起严重的免疫功能紊乱。本研究首先在大肠杆菌中对BLyS<,134-285>进行了可溶表达，获得了有活性的表达产物，以BLyS<,134-285>为靶蛋白对噬菌体随机12肽库进行亲和淘洗，筛选到一结合肽；其次将该肽与BLyS受体-B细胞成熟抗原(BCMA)胞外区序列比较，确定位点对BCMA进行了定点突变，并找到BCMA与BLyS<,134-285>结合的关键氨基酸；同时，我们用BLyS<,134-285>和FP248两种蛋白分别对噬菌体展示scFv文库进行淘洗，在获得各自高亲和力克隆的基础上，成功地将抗体噬菌体作为一抗在Western blot中应用，为Western blot中一抗的获得提供了一种新的途径。研究工作分为以下三个部分：
(1)在大肠杆菌BL21(DE3)中以低温诱导获得了BLyS<,134-285>的可溶性表达，经过Ni-NTA树脂纯化表达产物，纯度达到80％左右；分离小鼠脾脏B细胞，用MIT法测定BLyS<,134-285>对其的增殖情况，证实了BLyS<,134-285>的活性。以BLyS<,134-285>为靶蛋白对噬菌体展示随机12肽库进行了筛选。经过3轮淘洗，噬菌体产出与投入的比值逐轮升高，表明与BLyS<,134-285>特异性结合的噬菌体得到了富集。在洗脱时我们采用了酸洗脱与受体竞争洗脱相结合的形式，最后从第3轮高浓度受体洗脱下的噬菌体中，随机挑选20个克隆用ELISA测定结合活性，并将强阳性信号的克隆送出测序，多个克隆在测序后得到了同一个小肽序列(T1)。将T1与GST融合，在大肠杆菌获得高表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白50％，用Glutathione-agarose纯化后纯度高达95％。ELISA实验进一步确证了融合表达的T<,1>与BLyS<,134-285>的结合活性。(2)利用Vector NTI软件将T1与BCMA胞外区氨基酸序列进行比对，得到与T1最为相似的位点：Gln<25>、Leu<26>、Arg<27>和Thr<32>。用定点突变的方法构建了4株BCMA的突变体(mBCMA)： Q25D/R27Y、126G、R27Y以及Q25D，并分别将各个突变体与IgGlFc融合(mBCMA-FC1)，在大肠杆菌中获得了高效可溶表达，表达产物经Protein A-Sepharose纯化后，4株mBCMA-Fc1的纯度均在95％以上。最后通过ELISA检测证实突变体Q25D／R27Y、Q25D以及R27Y，同BLyS<,134-285>的结合活性较突变前变化较大，结合能力降低；突变体L26G同BLyS<,134-285>的结合活性较突变前变化较小。因此Gln<25>，Arg<27>氨基酸为与配体结合的关键区域，Len<26>对BCMA同配体的结合影响较小。
(3)以BLyS<,134-285>和即248为靶分别对噬菌体展示scFv文库进行筛选，各进行4轮淘洗后，特异性结合靶蛋白的噬菌体均得到富集，BLyS<,134-285>与FP248筛选的第4轮产率分别是第一轮的10<4>及10<,2>倍。从第四轮洗脱的噬菌体中各随机挑选20个克隆用ELISA鉴定它们与BLyS<,134-285>的结合活性。在获得各自高亲和力噬菌体克隆的基础上，考察抗体噬菌体可否作为抗靶蛋白的第一抗体用于Western blot。结果显示，抗体噬菌体作为一抗在Western blot中能够特异地检测出相应抗原，并且抗体噬菌体的稀释倍数同其与抗原之间的亲和力成正相关。为Western blot检测中一抗的获得提供一种新的途径。
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