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L-赖氨酸(L-Lysine)对人和动物的生长发育具有重要作用,由于不能通过转氨作用合成,是人和动物的必需氨基酸之一,被称为第一限制性氨基酸,广泛应用于食品加工,医药制剂,饲料添加剂等方面。目前世界市场对L-赖氨酸的年需求总量约为160余万吨,年增长率大约为7%-8%,因此提高L-赖氨酸的产量就显得十分重要。目前L-赖氨酸主要采用直接发酵法生产,生产菌株主要是诱变育种得到的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变菌株,存在生长速度缓慢,糖耗速率低,对外界不良环境耐受力差等缺点。本论文利用代谢工程技术构建大肠杆菌(Escherichia coli,简称E.coli)工程菌株,采用发酵法进行L-赖氨酸的生产,相比于背景尚不完全清楚的谷氨酸棒杆菌,基因操作较为简单,有利于菌种的进一步改造;菌体生长周期较短,培养方便,对生长条件要求低的大肠杆菌,更适合工业化生产L-赖氨酸。本论文首先构建了过表达及异源表达L-赖氨酸生物合成途径关键酶基因的工程菌株。将天冬氨酸激酶基因(lysC)克隆至载体pTrc99A上,构建成功的重组质粒pTrc99A-lysC转入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM11,以葡萄糖为底物摇瓶发酵,L-赖氨酸产量最高达到1.55 g/L。相比原始菌株E.coli ML103产量只有0.0036 g/L,提高了430倍。将谷氨酸棒杆菌二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)克隆至载体pACYCDuet-1上,构建成功的重组质粒pACYCDuet-1-ddh转入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM12,以葡萄糖为底物摇瓶发酵,L-赖氨酸产量最高达到1.38 g/L。当前工业化生产L-赖氨酸,对发酵液中的其它糖类利用不足,存在浪费问题,本论文将果糖-1,6-二磷酸酶基因(fbp)克隆至载体pTrc99A上,构建成功的重组质粒pTrc99A-fbp转入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM13,以果糖为底物摇瓶发酵,L-赖氨酸产量最高达到1.06 g/L。而原始菌株E.coli ML103几乎不产L-赖氨酸。为构建多基因共表达的工程菌株。本论文在质粒pTrc99A上克隆二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA),构建成功重组质粒pTrc99A-dap A;在重组质粒pTrc99A-lysC上克隆dapA基因,构建成功重组质粒pTrc99A-lysC-dapA。通过将重组质粒pTrc99A-lysC-dapA转入E.coli ML103中,构建工程菌株ZDZM21,L-赖氨酸产量最高达到2.33 g/L,比工程菌株ZDZM11提高了50.32%。将重组质粒pTrc99A-lysC和pACYCDuet-1-ddh同时转入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM22,L-赖氨酸产量最高达到2.42 g/L,相比工程菌株ZDZM11提高了56.13%,比ZDZM12提高了74.98%。将重组质粒pACYCDuet-1-ddh和pTrc99A-dapA同时转入E.coli ML103中,构建工程菌株ZDZM23,L-赖氨酸产量最高达到2.58 g/L,比工程菌株ZDZM12提高了86.55%。而将重组质粒pTrc99A-lysC-dapA和pACYCDuet-1-ddh同时转入E.coli ML103中,构建工程菌株ZDZM24,L-赖氨酸产量最高达到2.98 g/L,比工程菌株ZDZM22提高了23.14%,比ZDZM23提高了15.5%,比原始菌株E.coli ML103提高了828倍。本论文首次在过表达大肠杆菌自身关键酶基因的同时,将谷氨酸棒杆菌二氨基庚二酸脱氢酶基因引入到大肠杆菌L-赖氨酸的生产代谢途径中,提高了六氢吡啶二羧酸催化形成二氨基庚二酸的效率,提高了大肠杆菌对L-赖氨酸的生产能力同时又在大肠杆菌中过量表达其自身果糖-1,6-二磷酸酶基因,使大肠杆菌工程菌可以利用果糖生产L-赖氨酸,增加了大肠杆菌发酵底物的选择范围,使大肠杆菌发酵生产L-赖氨酸更为经济。