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目的研究EGR1对肌腱干细胞的诱导分化能力及EGR1、PRP相关生长因子对兔肩袖损伤后肌腱修复的影响。方法(1)采用酶消化法取新西兰大白兔髌韧带中间部分肌腱组织,经过酶切处理及培养后分离、纯化得到肌腱干细胞(TSCs),之后免疫荧光染色检测4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、TNMD抗体和SCX抗体并在荧光显微镜下观察进一步证实鉴定TSCs细胞。(2)用带有表达EGR1基因的质粒(pCDNA-EGR1)转染实验组TSCs,用空白质粒转染对照组TSCs。应用短片段发夹RNA(shRNA)lentiviral微粒靶向干扰TSCs中BMP12和Smad1基因的表达。在EGR1的作用下实验组和对照组的TSCs分别诱导培养14天向肌腱细胞分化,分离纯化得到肌腱细胞,应用免疫荧光染色和定量PCR对肌腱细胞进行鉴定,并对其相关基因表达进行检测。(3)通过RNA提取与实时定量PCR检测(qRT-PCR),在基因水平比较实验组和对照组TSCs分化生成肌腱细胞的能力,并在TSCs分化培养过程中(0h,12h,1d,3d,7d,14d)提取蛋白质并应用Western blotting检测:通过BMP12/Smad1/5/8通路生成的蛋白产物并与正常肌腱愈合时产生这些产物作比较。(4)建立兔肩袖损伤模型(共40只),每只实验动物切断右侧肩关节冈上肌肌腱,对左侧肩关节行假手术处理形成对照组。损伤模型建立后6周行肩袖修补手术,并将实验动物分为三组(每组10只):A组,单纯修补手术;B组,修补手术+TSCs植入(肌腱损伤部位);C组,修补手术+EGR1-TSCs植入(肌腱损伤部位)+PRP注射(肌腱-骨界面)。肩袖修补手术后8周,处死所有组实验动物,获取每只实验动物双侧肱骨大结节连同附着于其上的冈上肌肌腱。每组取出3分样本用于mRNA提取和蛋白质提取(用于Western blotting);每组中剩余组织样本(包括取自手术修补部位的冈上肌肌腱及肱骨大结节)制成5μm厚的石蜡切片,进行HE染色、免疫组化分析及来评估I型胶原蛋白的形成情况,评价肌腱的愈合情况。结果(1)TSCs肌腱干细胞培养成功,DAPI标记的第三代TSCs细胞核可见明亮蓝色荧光(图3),标记率达100%,细胞活性较高。NMD、SCX染色细胞质呈绿色荧光,可观察细胞整体形态及分布状况良好。(2)实验组TSCs表达EGR1基因,对照组TSCs无表达。短片段发夹RNA(shRNA)lentiviral微粒靶向干扰TSCs中分化成功,分离纯化得到肌腱细胞,免疫荧光染色和定量PCR对肌腱细胞进行鉴定显示为肌腱细胞。(3)RNA与实时定量PCR检测(qRT-PCR),显示实验组TSCs分化生成肌腱细胞并应用Western blotting检测,得到BMP12/Smad1/5/8通路生成的蛋白产物并与正常细胞相同。(4)兔肩袖损伤模型建立成功,HE染色、免疫组化分析均显示I型胶原蛋白的形成情况良好,肌腱的愈合情况良好。结论EGR1对肌腱干细胞的诱导分化能力较好,EGR1、PRP相关生长因子对兔肩袖损伤后肌腱修复具有积极作用。