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1 含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用 目的 建立癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）基因启动子驱动的含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（E．Coli. cytosine deaminase，EC-CD）自杀基因的重组腺病毒载体AdCEACD，研究CEA启动子控制EC-CD基因在CEA阳性的细胞中专一性表达并专一性杀伤的可行性。 方法 采用同源重组法在293细胞中重组腺病毒，用点杂交、PCR法进行鉴定，用CsCl密度梯度超离心法纯化病毒，用空斑形成试验进行病毒滴度测定。以由巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子驱动EC-CD基因的重组腺病毒载体AdCMVCD为参照。体外分别感染CEA阳性（Lovo、HCT1116BG细胞）和CEA阴性（Hela、CT26细胞）细胞，用MTT法检测受染细胞5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）的敏感性，并计算半数杀伤浓度（fifty percent inhibition concentration，IC50）；用RT-PCR法检测受染细胞EC-CD基因mRNA的表达。用Lovo、CT26细胞接种Balb／c nu／nu裸鼠皮下制成动物模型，瘤内接种病毒载体，腹腔给予5-FC，治疗结束测量肿瘤体积；测定不同治疗组鼠外周血谷丙转氨酶与谷草转氨酶（ALT与AST）；并取鼠股骨骨髓涂片行瑞氏染色，观察骨髓增殖情况。 结果 鉴定显示重组腺病毒中含有CEA基因及EC-CD基因，纯化后滴度可以达到5.0×1011pfu／ml，CEA阴性的Hela、CT26细胞感染AdCMVCD后对5-FC敏感性增强，IC50明显降低（p＜0.01），而感染AdCEACD后不能被5-FC杀伤；CEA阳性的Lovo、HCT1116BG细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性，均对5-FC敏感，IC50均明显降低（p＜0.01）。AdCEACD／5-FC系统有明显的旁观者效应，当受染细胞比例仅为10％时，细胞存活率约为30％。RT-PCR检测显示Lovo细胞感染AdCEACD及AdCMVCD后均可检测到EC-CD mRNA表达；Hela细胞感染AdCMVCD后可以检测到EC-CD mRNA表达，但在AdCEACD感染后则没有EC-CD 南京医科大学博士学位论文mRNA表达。在 LoVO细J解鼠实验中，娜 AdCMVCD或 AdCEACD后，给予前药 5IC，］摘生长均明则中制中对．01)；在 Ch6细赠鼠实验中，接种 AdCMVCD kr予前药 5－FC，j殖生长亦明显抑制（仰．of），6在接种AdC矾CD gjb予 5－FC后顺生长敞明显影响。Lnvo细B解鼠实验中单用5FC或单用AdC一、AdCMVCD、AdCEACD等病毒对裸鼠ALT、AST M明显影响，邮同时树5几组，ALT、AS T均有不同程度增力。Lovo细月解鼠实验中巩理红u叉AdCEACD／5FC治疗组骨姚生明显活跃，而AdC MVC D／5IC治疗懈鼠骨姚生活民 与前两者相L匕骨雕生明显受抑。鳅 本实验建立的C巩启动于驱动的含ECcD 自杀基因的腺病毒载体A丸EAC D，s眼EC－CD基因专一性地在C以阳性细胞中表达，银专一性杀伤作用。与AdCMV D比较，AdC EAC D对动物骨朝一定的防作用。该载体基本站q实马幼女子十要求，有助于实测 CEA阳性肿瘤的靶向性自杀基因治疗。二胞感喷出铅印海基因用一刍IL－2、Dw什基因治疗大J防癌目的 研究胞喀淀脱氨酶基因（ECCD）懈fiE、e’一性＠对蛐癌的治疗作用。方法 分别以重组腺病毒狲AdC MVC D、AdC EAC D溺EC－CD基因；AdCMVflM电转导人 n上基因；AdCMVIN’F介树鼠 INF个基因。分别在体外、内（B撇 ＂u／nU裸眼 B测，J、鼠）晌 EC－CD基因一 IL－2基因对Lov细脚贿、以及EC －CD基因鹏鼠o：F个基因对CD6细B附瘤的治疗作用。体内联合 疗结述或中瘤行常规HE染色进行组织学检查。结果 LoV细月响 C126细胞分另IJ受 AdCMVIL七、AdC… Y感射细B旺长受到比较明助制。鹏AdC MVIN’F－Y可以增强AdCMVCD／FC对Cn6细胞的杀伤作用，ICSO明显变小（问．卿1），B贿生长明显抑制 中旬对见)。懈AdC MVn2亦增强AdC EAC孤FC对LoV细胞的细胞村用（问．05），肿瘤生长亦明别叩制（叼．000），用y个 疗的效果与单用A优MVC D／5－FC鞭。组织派查显示m毛D基因与D－2、M裕固鹏治疗组肿瘤内有大饼巴细胞浸润，助小鼠B惋b解鼠B贴中更明显。 3 南京医科大学博士学位论文规 故LZ或M仅因可以明显增强m毛D基因 中瘤加，且可V弥q除向性附治疗效率较差的缺点。局部淋巴细B吸润增加可5脚卜 定作用。3is．M＊AnwiAn因联合化学药物治疗大肠癌目的 研究鹏一因（ECCD）联合化学药物对蛐癌的治疗作用。方法 以重娜病毒AdCMVCD为载体转导EC－CD基因，化学药物阈．顷铂（中l咖，CDm）及丝辩素 C（d一体 C，MMC）。体夕卜究化学药物对AdC MV C孤一W系统撤杀伤作用及旁胀加的影响。以LoVO细胞Blb／m加州裸鼠皮下移鹏为例，研究懈EC－CD基因与化学药物对蛐癌的治疗作用，并用流或细胞树测治疗后肿瘤中凋亡细胞比例。结果 病毒感染并不影响LoVO细则CDD P、WC的雅性；低剂量CDDP、MMC即可明显增强AdCMVC孤儿系统的就杀瘤作用，5－FC对 LoVO细胞的 IC。p000州，当