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背景:基于肿瘤干细胞自我更新特性的单细胞扩增是实现肿瘤干细胞分选和富集的重要途径。传统的平板悬浮培养方法由于存在自发性细胞聚集因而富集效果有限。微流控液滴技术具有高效的样品分散能力,因而可以通过构建大规模单细胞培养阵列实现肿瘤干细胞的选择性扩增。目的:利用肿瘤干细胞的自我更新特性,借助于微流控液滴辅助大规模单细胞培养实现结肠癌干细胞选择性扩增。方法:研究设计并加工了一种多层结构微流控芯片,用于实现基于液滴的单细胞培养阵列构建和连续细胞培养。研究内容包括:（1）发展并优化了基于液滴微流控技术的单细胞分散和培养方法,并以结肠癌细胞系和手术切除结肠癌组织来源细胞验证了该方法的可行性;（2）发展了一种基于凝胶-溶胶转换的芯片培养细胞回收方法;（3）使用一系列芯片上和芯片外分析方法,包括干性标志物和再成球实验验证了液滴辅助单细胞培养对于结肠癌干细胞的富集效果。结果:实验以添加1%海藻酸钠、25 mmol·L-1 Ca2+-EDTA和DMEM培养基的细胞悬液为分散相,以含1%PFPE-PEG-PFPE 7500氟化液为连续相,利用微流控液滴技术可在10min内构建20,000以上的液滴阵列。通过控制输入细胞密度,可以获得～29%的细胞包裹比例,其中包含单细胞液滴比例>67%,因此单次可以制备4000以上单细胞包裹液滴。完成细胞分散后,引入含0.05%冰醋酸的7500氟化液引发液滴中海藻酸钙形成,因而形成了非贴附性水凝胶支持的单细胞培养环境。连续培养中,只有少量细胞可以存活并形成肿瘤球。HCT116细胞单细胞成球比例为1.93±0.49%,HT29细胞单细胞成球比例为6.26±1.01%。芯片原位免疫荧光成像显示,单细胞源肿瘤球显示为Lgr5高表达,SOX2阳性。完成细胞培养后,芯片引入含10 mmol·L-1 EDTA生理盐水引发海藻酸钙水凝胶解聚,因而生理盐水的10 mmol·L-1 EDTA溶液实现了芯片培养细胞的释放和回收。回收细胞流式荧光分析显示,相比传统的悬浮培养方法,扩增HCT116细胞中ALDH、CD133、Lgr5阳性比例分别增加了22.5%、8.4%、55.7%,扩增HT29细胞中ALDH、CD133、Lgr5阳性比例分别增加了14.5%、11.8%、61.4%。扩增原代结肠癌细胞中CD133、CD44、Lgr5阳性细胞比例分别增加了15.27%、41.9%、23.36%。利用回收的HCT116细胞再成球实验显示,扩增后细胞的单细胞成球比例提高了9.16%。结论:研究发展了一种微流控液滴辅助的肿瘤干细胞富集方法,可以通过大规模单细胞培养实现肿瘤干细胞选择性扩增。研究结果显示该方法可以有效地富集结肠癌干细胞,且具有简便和高效的优势,有望为肿瘤干细胞研究提供一种有力工具。