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高致病性H5亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)流行广泛,宿主种类多,变异频繁,易与其他基因型病毒发生重组,可导致毒株毒力、宿主嗜性、保护性抗原变化。水禽作为禽流感病毒的天然宿主和传播重要媒介,严密跟踪水禽中H5亚型禽流感野毒株的变异动态,对主动预防H5亚型禽流感和维护公共卫生安全具有重要意义。本试验自2015年2月至2018年12月在珠三角地区共收集1107份禽组织样品和808份禽棉拭子样品,通过特异性PCR扩增从中共鉴定获得H5亚型AIV阳性的基因样品110份。根据HA基因的核苷酸序列相似性和遗传进化分析,建议将2017年与2018年间共55份H5N6亚型AIV HA基因划分到新的分支并命名为clade2.3.4.4f。其余54份样品序列的HA基因属于clade2.3.4.4d分支,1份属于clade2.3.4.4e分支。氨基酸位点分析结果显示,110份H5亚型AIV HA基因裂解位点均呈高致病性禽流感病毒特征,S137A、T160A、D187N、D187S、A188E、Q196K、Q226L、S227R、G228S氨基酸的突变使多个样品序列具有亲嗜α2,6唾液酸受体的倾向。HA蛋白新增了第70-72、135-137、140-142、209-211位的潜在糖基化位点,其中clade2.3.4.4f分支均具有第140-142位新增的糖基化位点。根据NA基因测序及其核苷酸序列相似性和遗传进化分析,表明上述110份样品序列NA基因均属于N6血清亚型,其中110份样品序列均出现NA茎部氨基酸缺失。从110份新鉴定H5N6亚型AIV样品序列中依据时间分布和HA基因分支代表性情况选取16份代表序列对其6个内部基因进行测序,并作遗传进化、氨基酸位点分析。结果显示,PB2基因来源于禽流感欧亚谱系中的ST339-like分支,PB1、PA、NP、M、NS基因来源于禽流感病毒欧亚谱系中的H5-like。M2、NA蛋白未出现影响耐药特性的位点突变。分析显示16份样品序列NP基因与本实验室在2016年分离于鸭群的A/duck/Guangdong/A9/2016(H9N2)毒株的相似性在97.7%~99.6%,且同属于H5-like,提示此NP基因在珠三角地区多个血清亚型禽流感病毒中存在。本试验挑选了水禽源clade2.3.4.4f分支并具有140-142位新增糖基化位点的代表性样品序列A/Goose/Guangdong/1807-6/2018(H5N6)(GS/1807-6),并以疫苗株A/chicken/Guizhou/4/2013(H5N1)(Re-8)作对照,构建HA蛋白原核表达系统、并优化表达条件。纯化获得的HA蛋白,进一步分别用抗His标签蛋白抗体与抗H5亚型禽流感HA蛋白特异性抗体为一抗进行Western Blot验证,结果显示在56 k Da位置均出现一条清晰的蛋白印迹,表明成功原核表达获得HA(GS/1807-6)蛋白与疫苗株Re-8的HA蛋白,为实验室对H5亚型AIV HA蛋白相关下游试验提供一定基础。