流体剪应力作用下,骨髓间充质干细胞(MSCs)的分化趋势及机制被越来越多关注和研究。本实验室之前的实验结果表明不同增加速度的单向流体剪应力同时调控了骨髓间充质干细胞的分化方向和细胞骨架F-actin的重排。本论文以此为基础,探讨了不同速度增加的单向流体剪应力在调控骨髓间充质干细胞分化过程中细胞骨架F-actin重组装对该机制的调控作用,进一步考察了骨髓间充质干细胞在不同增加速度的单向流体剪应力作用下力学敏感型钙离子通道对F-actin重组装的影响。主要研究内容和结果如下:以6周龄Sprague Dawley大鼠来源的第三、四代MSCs为实验研究对象,使用平板流动腔装置对细胞骨架固定剂鬼笔环肽(Phalloidin)预处理后的MSCs施加三种不同增加速度的单向流体剪应力,即0分钟从0 dyn/cm2线性增加到10dyn/cm2、2分钟从0 dyn/cm2线性增加到10 dyn/cm2、20分钟从0 dyn/cm2线性增加到10 dyn/cm2(分别简化为0-0’、0-2’、0-20’)。完成20分钟力学加载并通过荧光染色即时观察细胞骨架F-actin聚合情况并量化其荧光强度得到细胞骨架F-actin聚合程度的数据。结果显示,Phalloidin抑制组的细胞连续F-actin的量化结果均大于静态对照组,但均小于相同加载方式下而未进行预处理的实验组,说明不同线性增加的单向流体剪应力调控了MSCs细胞骨架F-actin的重排,且0-2’加载方式使MSCs的F-actin聚合度最大,相比之下0-20’力学刺激方式对细胞骨架F-actin聚合度影响最小。加载条件下Phalloidin不能完全抑制F-actin重排。在发现上述结果后,为考察细胞骨架F-actin在不同增加速度的单向流体剪应力调控MSCs分化中的作用,本文分别检测了MSCs的成骨向(碱性磷酸酶,ALP)和软骨向(糖胺聚糖,GAG)分化标志物。结果表明,三种加载方式作用于MSCs20分钟并静态培养48小时后,在Phalloidin非抑制组中实验结果与课题组已得到的结论一致,即0-2’加载组的ALP表达最多,且与其他组包括静态组均有显著性差异;而0-0’加载组的GAG表达结果最大,且与其他组包括静态组均有显著性差异。所以我们认为0-2’力学刺激可促进MSCs向成骨细胞系分化,0-0’力学刺激则可促进MSCs向软骨细胞系分化;而Phalloidin抑制组中三种方式的力学加载组的ALP和GAG量化结果之间均没有显著差异性。表明不同增加速度的单向流体剪应力通过调控细胞骨架F-actin重组进而影响了MSCs成骨向和软骨向分化趋势。为进一步探讨Phalloidin试剂对MSCs分化的影响同样使用细胞骨架F-actin稳定剂Phalloidin预处理MSCs并完成三种方式力学加载,分别用含有和不含有Phalloidin的培养基静态培养48小时后检测细胞ALP及GAG的含量。我们发现在含有和不含有Phalloidin试剂的两种静态培养条件下,各加载组之间ALP和GAG量化结果并没有差异性,说明Phalloidin试剂本身对细胞ALP和GAG的表达没有影响,同时也验证了之前我们得到的结论,不同增加速度的单向流体剪应力通过影响细胞骨架F-actin重组进而调控了MSCs成骨向和软骨向分化趋势。实验室前期研究已发现,力学敏感型钙离子通道与细胞骨架F-actin重排有着密切关系。但与MSCs的分化是否相关以及该通道是否通过F-actin重排调控MSCs分化尚不知晓。基于此,我们在力学加载前用力学敏感型钙离子通道阻滞剂GdCl3作用MSCs以实现阻滞作用,20分钟的力学加载后48小时静态培养,检测MSCs骨向和软骨向分化标志物的表达水平。通过比较力学敏感型钙离子通道阻滞剂作用的实验组和未进行阻滞作用的实验组的分化标志物的表达结果,我们发现MSCs受到不同速度增加的单向流体剪应力加载作用时,细胞骨架F-actin的响应有赖于力学敏感型钙离子通道不同程度的开放。综合上述研究结果,不同增加速度的单向流体剪应力通过MSCs力学敏感型钙离子通道调控细胞骨架F-actin重组进而调控其成骨向和软骨向分化趋势。该研究初步揭示了MSCs的在不同力学刺激下的分化调控方式及其机制,为生物力学刺激更好地在骨/软骨损伤修复中的应用提供参考。