论文部分内容阅读
热应激是影响动物生长和生产效率的重要因素之一,研究动物热应激反应机制具有重要的理论意义和实用价值。研究发现microRNAs (miRNA)参与了机体多种生物学过程的调节,随着高通量测序技术在miRNA研究中的广泛应用,小RNA测序(miRNA-seq)技术可挖掘动物不同热应激下功能相关的miRNAs。通过比较不同生物学过程中差异表达的miRNAs,可以为解释热应激下动物生理变化提供依据,并发掘与热应激调控相关的miRNAs。本试验于重庆市良种肉牛场选取5头体况良好、年龄体重且相同饲养管理的红安格斯母牛作为研究对象,分别在热应激和非热应激下测定牛直肠温度和呼吸频率,并用真空采血针于颈静脉采集牛外周血为试验材料。测定了热应激和非热应激下牛血清生化指标、抗氧化指标以及免疫相关指标。同时构建了2个小RNA文库即热应激HH和非热应激HC,采用Solexa测序方法筛选出2文库中各类型的miRNAs。对2个文库的miRNAs表达谱分析,筛选出差异表达的miRNAs。利用靶基因预测软件Targetscan,预测了差异表达miRNAs调控的靶基因,并通过GO和Pathway分析预测了这些靶基因参与的生理过程,从而解释差异表达miRNAs在不同热应激环境下的功能差异。生理生化指标分析发现,热应激下牛直肠温度和呼吸频率极显著高于非热应激(P<0.05)；血清中阳离子K+、Na+和Ca+浓度低于非热应激(P>0.05),阴离子C1-浓度显著低于非热应激(P<0.05),表明热应激下牛机体内环境失衡；热应激下总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低(P<0.05),过氧化物歧化酶(SOD)活性极显著低于非热应激(P<0.01),丙二醛(MDA)显著高于非热应激(P<0.05),表明热应激下牛抗氧化能力下降；血清中IgA和IgG含量显著降低(P＜0.05), IgM含量低于非热应激(P>0.05), IL-2, IL-6和IL-10含量降低,IL-4和IL-8含量高于非热应激,表明热应激下牛免疫功能下降。2个小RNA文库Solexa测序共获得191万条序列种类以及2,534万条总拷贝数。剔除冗杂序列,非miRNA等序列后,获得73万条clean reads,对应总的序列拷贝数1,959万条,并且reads长度满足Dicer酶切割特征。将获得的clean reads与各数据库进行比对,共挖掘1011个miRNAs,其中牛中已知的niRNAs546个,种间保守的miRNAs168个以及新预测了297个miRNAs;试验发现267个pre-miRNAs的5’和3’共表达,说明miRNAs的调节具有复杂性。对构建的表达谱分析发现,2个文库中832个miRNAs共表达,HH和HC文库中分别有89和90个miRNAs特异表达；2文库中拷贝数在3-100的miRNAs平均占总数量的64.78%,而排名前20miRNAs的拷贝数平均占总拷贝数的70.63%,表明文库中少量miRNAs高表达。分析热应激和非热应激下2个文库中miRNAs差异表达发现,315个miRNAs存在差异表达(尸<0.01),其中热应激下118个miRNAs表达上调,197个miRNAs表达下调。筛选出热应激下表达上调和下调前10位的miRNAs进行靶基因预测和GO及Pathway分析,结果显示,在热应激下表达上调的niRNAs调控的基因主要参与细胞凋亡、增值和蛋白激酶级联反应,在热应激下表达下调的miRNAs主要参与免疫功能的调节。通过本试验的研究,不仅揭示了热应激对牛生理生化指标的影响,新发现了牛外周血中表达的候选miRNAs,还从miRNAs的角度初步分析了热应激和非热应激下牛机体生物学调控差异,为肉牛的抗热应激选育提供依据。