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研究目的探究miRNA-451对RF/6A视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成能力等生物学特征的影响及其可能的机制,为增殖性糖尿病视网膜病变的治疗提供理论基础。方法1.利用脂质体转染法将miRNA-451的类似物(mimic)和抑制剂(inhibitor)转染进RF/6A细胞中,测定转染效率。2.将RF/6A细胞分为四个组:miRNA-451 mimic组、miRNA-451 mimic control(类似物对照)组、miRNA-451 inhibitor组、miRNA-451 inhibitor control(抑制剂对照)组,利用CCK-8检测细胞增殖能力,细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Matrigel管腔形成实验观察细胞形成管腔的能力。RT-PCR检测与生物学行为相关基因的表达情况。3.以miRNA-451为研究对象,利用mi RBase、mi Randa、Target Scan、Pic Tar等数据库对miRNA-451的作用靶点进行生物信息学分析,为实验提供理论指导和依据。4.利用SPSS 19.0软件对实验结果进行统计学分析。组间的两两比较需要采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05则认为差异具有统计学意义。结果1.转染效率检测的结果显示,6h后miRNA-451 mimic组在20u M时即有较高的转染效率,miRNA-451 inhibitor组在80u M的转染效率较高。2.CCK-8细胞增殖实验结果显示:24h时,mimic组(1.049±0.020)较mimic control组(1.258±0.034)低,结果有统计学差异(F=0.413,P=0.000)。48h时mimic组(1.223±0.077)较mimic control组(1.400±0.037)低,结果具有统计学差异(F=2.401,P=0.002)。inhibitor组与inhibitor control组相比较,24h时,两组间无统计学差异(P>0.05),48h时,inhibitor组(1.748±0.023)较inhibitor control组(1.689±0.421)高,结果有统计学差异(F=1.407,P=0.000)。3.划痕实验结果显示:miRNA-451 mimic组与mimic control组在观察的时间段内无统计学差异。6h时miRNA-451 inhibitor组(0.106±0.036)较inhibitor control组(0.239±0.030)低,结果有统计学差异(F=0.039,P=0.008),12h时miRNA-451 inhibitor组(0.248±0.045)较inhibitor control组(0.445±0.053)低,结果有统计学差异(F=0.227,P=0.008)。24h时无统计学差异(P<0.05)。4.Transwell结果显示:miRNA-451 mimic组与mimic control组在观察的时间段内无统计学差异(P<0.05)。miRNA-451 inhibitor组(57.750±8.655)较inhibitor control组(103.000±9.618)低,结果有统计学差异(F=0.011,P=0.000)。5.Matrigel管腔形成结果显示:miRNA-451 mimic(60.667±8.7369)组较mimic control(16.000±6.000)组高,结果有统计学差异(F=0.688,P=0.002)。miRNA-451inhibitor组(24.667±3.786)较inhibitor control组(65.333±5.033)低,结果有统计学差异(F=0.163,P=0.000)。6.RT-PCR结果显示:(1)Cyclin A1的表达,24h时mimic组(0.424±0.033)低于mimic control组,差异具有统计学意义(F=15.923,P=0.000),inhibitor组(0.042±0.042)低于inhibitor-control组,具有统计学差异(F=14.899,P=0.000);(2)Cyclin D1的表达,24h时mimic组(0.744±0.105)低于mimic control组,结果具有统计学差异(F=5.088,P=0.014),inhibitor组同inhibitor-control组间无统计学差异(P>0.05);(3)PDGFRα的表达,24h时mimic组同mimic control组间无统计学差异(P>0.05),inhibitor组(1.762±0.285)高于inhibitor-control组,结果具有统计学差异(F=5.549,P=0.01);(4)MMP2的表达在24h时,mimic组(0.535±0.084)低于mimic control组,差异具有统计学意义(F=11.495,P=0.001),inhibitor组(0.042±0.016)低于inhibitor-control组,具有统计学差异(F=8.910,P=0.000)。7.生物信息学结果表明,miRNA-451主要参与调节细胞发育、负性调节细胞增生及多种酶活性等生物学过程(P<0.05),可能与转化生长因子-β信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、表皮生长因子信号通路、Wnt信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路、趋化因子信号通路、脂肪酸代谢通路(P<0.05)等通路相关。结论1.通过脂质体转染法,miRNA-451 mimic和miRNA-451 inhibitor可以有效的上调或下调RF/6A血管内皮细胞中miRNA-451的表达。结果显示抑制细胞中miRNA-451表达的结果更有意义。当细胞中miRNA-451的表达降低时,增殖行为所受影响不大,细胞迁移受到抑制,形成管腔的能力下降,提示利用miRNA-451治疗PDR具有潜在的可能性。2.在下调miRNA-451表达水平后,Cyclins、PDGFRα和MMP2变化的趋势与细胞形态学的改变相吻合,提示Cyclins、PDGFRα和MMP2可能参与miRNA-451作用RF/6A细胞生物学行为的过程。其中,Cyclins和PDGFRα可以反映细胞增殖能力,MMP2反应细胞迁移能力。3.miRNA-451对RF/6A细胞的影响可能是经由多种信号通路介导的复杂过程,将其作为治疗靶点需要注意其可能出现的其他副作用。