酶可与底物高特异性结合,在温和的条件下高效催化复杂的生化反应,广泛应用于医药、化工、食品、环境保护等行业。酶固定化一般可提高其稳定性。酶的共价、定向固定化使酶以确定的方向排列,利于保护酶催化功能,利于底物和活性中心结合。本实验使用目前制备技术成熟、应用广泛、与巯基进行特异性反应的载体,将可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽（SRP）或酰基载体蛋白（ACP）与目的蛋白融合（SRP-目的蛋白、ACP-目的蛋白）,3,4-二溴马来酰亚胺可逆修饰目的蛋白表面的巯基,探索高效的4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰方法。以修饰后SRP或ACP的4’-磷酸泛酰巯基乙胺（巯基）为抓手,建立目的蛋白的高效、定向、共价及条件温和的固定化新方法。在此过程中,磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（大肠杆菌Acp S、枯草芽孢杆菌Sfp）发挥关键作用。本实验构建了一系列表达载体,分析筛选高可溶性表达方法,结果表明,当ACP作为融合标签与Acp S和Sfp的N末端相连时,能増加目的蛋白的可溶性表达量;当SRP作为融合标签与Acp S和Sfp的N末端相连时,融合蛋白表达量均很少,而当SRP作为融合标签与Acp S和Sfp的C末端相连时,虽然融合蛋白表达量高,但是溶解性低。融合蛋白之间以柔性短肽（LP1:GPASGGGGA、LP2:GGPPGG）连接,降低融合蛋白质之间的结构干扰。本实验还探究了融合蛋白之间连接短肽对PPTase重组表达的影响,结果表明,短肽LP2比LP1可能更有效降低ACP与Sfp之间的结构干扰,而LP1比LP2可能更有效ACP与Acp S蛋白质之间的结构干扰,获得较高的可溶性表达量。纯化得到的融合蛋白his-ACP-LP2-Sfp经3,4-二溴马来酰亚胺封闭巯基后,利用融合蛋白可自修饰,以修饰后ACP的高活性巯基,介导融合蛋白与Sulfo Link树脂共价结合,实现Sfp在Sulfo Link树脂上有序、定向固定化,其饱和固定量为9.58 mg/m L基质。被3,4-二溴马来酰亚胺封闭表面巯基的ACP-m Cherry、ACP-GFP经固定化his-ACP-LP2-Sfp催化后,可固定于基质,说明固定化his-ACP-LP2-Sfp具有一定的生物学活性。