【摘 要】
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目的:观察亚砷酸钠（Sodium arsenite,NaAsO2）对SH-SY5Y、HT-22细胞自噬及Hippo-YAP通路的影响及其内在机制。方法:以SH-SY5Y、HT-22细胞为研究对象,设置不同浓度的NaAsO2（0、6.25、12.5、25、50、100μM）处理组,分别处理细胞（24、48、72 h）后,通过MTT法检测其细胞活力的变化;透射电子显微镜观察NaAsO2处理SH-SY5
【基金项目】
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国家自然科学基金； 贵州省卫健委科技基金项目；
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目的:观察亚砷酸钠（Sodium arsenite,NaAsO2）对SH-SY5Y、HT-22细胞自噬及Hippo-YAP通路的影响及其内在机制。方法:以SH-SY5Y、HT-22细胞为研究对象,设置不同浓度的NaAsO2（0、6.25、12.5、25、50、100μM）处理组,分别处理细胞（24、48、72 h）后,通过MTT法检测其细胞活力的变化;透射电子显微镜观察NaAsO2处理SH-SY5Y细胞后自噬小体的形成情况;激光扫描共聚焦显微镜观察NaAsO2处理后SH-SY5Y细胞内LC3荧光斑点的聚集情况;Western blot实验检测不同浓度NaAsO2（0、12.5、25、50μM）作用SH-SY5Y细胞24 h以及NaAsO2 50μM作用不同时间（0、12、24、48 h）后自噬相关蛋白（LC3、p62、Beclin 1）、溶酶体膜蛋白（LAMP1、LAMP2）、Hippo-YAP信号通路相关蛋白（MST1/2、LATS1、YAP、p-MST1/2、p-LATS1、p-YAP）表达水平的变化,并检测不同浓度NaAsO2（0、6.25、12.5、25μM）作用HT-22细胞24 h后自噬相关蛋白（LC3、p62、Beclin 1）、溶酶体膜蛋白（LAMP1、LAMP2）表达水平的变化;采用核质分离和细胞免疫荧光检测NaAsO2处理SH-SY5Y细胞后YAP蛋白的核质分布情况;Lysotracker red染色观察NaAsO2处理SH-SY5Y细胞后溶酶体相对荧光强度;Hippo-YAP通路抑制剂XMU-MP-1预处理SH-SY5Y细胞后再用NaAsO2处理,然后用MTT法检测各组细胞活力,Western blot检测Hippo-YAP信号通路相关蛋白（MST1/2、LATS1、YAP、p-MST1/2、p-LATS1、p-YAP）的变化,同时检测自噬相关蛋白（LC3、p62）、溶酶体膜蛋白（LAMP1、LAMP2）的表达变化,Lysotracker red染色观察溶酶体相对荧光强度;以RNA干扰技术敲低SH-SY5Y细胞内的YAP表达后再用NaAsO2处理,然后用MTT法检测各组细胞活力,Western blot检测自噬相关蛋白（LC3、p62）、溶酶体膜蛋白（LAMP1、LAMP2）的表达变化,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内LC3荧光斑点的聚集情况,Lysotracker red染色观察溶酶体相对荧光强度。结果:NaAsO2以时间-剂量依赖性的方式抑制SH-SY5Y、HT-22细胞活力（P＜0.05）;NaAsO2暴露导致SH-SY5Y细胞自噬体数量增多;Western blot检测结果显示,NaAsO2暴露后以时间-剂量依赖性的方式显著增加SH-SY5Y细胞内LC3-I、LC3-II和p62蛋白表达（P＜0.05）;剂量依赖性地诱导HT-22细胞内LC3-II、p62蛋白表达的增加（P＜0.05）,而对Beclin 1的表达无显著影响（P＞0.05）;细胞免疫荧光结果显示经NaAsO2处理后SH-SY5Y细胞内LC3蛋白发生点状聚集,自噬小点与对照组相比显著增多（P＜0.05）;NaAsO2可抑制SH-SY5Y细胞自噬流（P＜0.05）;NaAsO2可使SH-SY5Y细胞中Lysotracker red红色荧光强度显著降低,NaAsO2可呈时间-剂量依赖性的显著下调SH-SY5Y细胞中溶酶体膜蛋白（LAMP1、LAMP2）的表达（P＜0.05）;可剂量依赖性地显著下调HT-22细胞中溶酶体膜蛋白（LAMP1、LAMP2）的表达（P＜0.05）;NaAsO2处理SH-SY5Y细胞后虽未明显改变MST1/2蛋白表达水平（P＞0.05）,但可剂量依赖性地诱导细胞内LATS1蛋白表达水平上调（P＜0.05）、显著下调胞核、胞浆、以及细胞总蛋白中YAP蛋白表达（P＜0.05）、剂量依赖性地显著上调p-MST1/2、p-LATS1和p-YAP蛋白表达水平（P＜0.05）;XMU-MP-1阻断Hippo-YAP信号通路后,NaAsO2引起的SH-SY5Y细胞活力下降、溶酶体的抑制以及自噬流阻滞均得到有效的缓解（P＜0.05）;YAP敲低后进一步加剧NaAsO2引起的SH-SY5Y细胞活力抑制、细胞溶酶体的抑制以及细胞自噬流的阻滞（P＜0.05）。结论:1.NaAsO2能够抑制细胞溶酶体、阻滞细胞自噬流诱导SH-SY5Y细胞或HT-22细胞自噬;2.可被NaAsO2激活的Hippo-YAP通路参与抑制细胞溶酶体、阻滞细胞自噬流,从而诱导SH-SY5Y细胞自噬。
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