论文部分内容阅读
目的：研究小檗碱(Berberine, BBR)对2型糖尿病(Type2 Diabetes, T2DM)大鼠干预的结果,明确小檗碱对2型糖尿病大鼠的治疗效果；观察小檗碱对2型糖尿病大鼠肾脏和心脏的影响,了解小檗碱对2型糖尿病并发症的作用；分析磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-Kinase, PI3-K)和葡萄糖转运蛋白4(Glucose Transporter, GLUT4)在骨骼肌、心肌、肝脏和肾脏的表达,探讨小檗碱对2型糖尿病作用的可能机制。材料与方法：第一部分：小檗碱对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响。采用高脂高糖饲养加尾静脉注射小剂量(25mg·kg-1)链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)的方法制备2型糖尿病模型,将成模大鼠随机分为BBR组、T2DM组、MET(盐酸二甲双胍,Metformin)组和B+M(中西医结合)组,另设CON(正常对照)组和HFS(高脂高糖对照,High-Fat-Sucrose Diet)组。每组15只大鼠,分别给予不同处理因素：BBR组,BBR 100mg·kg-1·d-1灌胃；MET组,MET 50mg·kg-1·d-1灌胃；B+M组, BBR 100mg·kg-1·d-1+MET 50mg·kg-1·d-1灌胃(隔30’)；T2DM组、CON组和HFS组,0.9%NaCl 2ml·d-1灌胃。分别于成模后3d、4w、8w和12w断尾取静脉血检测血糖、血脂(TC、TG)及胰岛素浓度；观察大鼠的一般状况；记录各时间点各组大鼠体重和饮水量的变化。第二部分：BBR对2型糖尿病大鼠肾脏病理变化的影响。除不设(HFS组)外,其余动物饲养、造模、分组、处理因素同第一部分,分别于4w、8w和12w常规麻醉后取材。高碘酸-希夫(PAS)反应检测各组大鼠肾脏二醇基物质,光镜观察各组大鼠肾脏形态结构的变化,体视学方法分析肾小管体密度,肾小管和肾小球囊基底膜的厚度；电镜观察各组大鼠肾脏超微结构的改变；免疫荧光染色观察GLUT4的表达,并做光密度分析。第三部分：BBR对2型糖尿病大鼠心肌保护作用的研究。动物饲养、造模、分组、处理因素和取材时间同第二部分。高碘酸-希夫(PAS)反应检测各组大鼠心肌二醇基物质,光镜观察各组大鼠心肌形态结构的变化,并做光密度分析；免疫印迹法检测GLUT4在心肌的表达。第四部分：BBR对2型糖尿病大鼠胰岛素信号传导通路的影响。动物饲养、造模、分组、处理因素和取材时间同第二部分。用免疫印迹法检测PI3-Kp110亚基和GLUT4在肝脏和骨骼肌的表达。结果：1 BBR对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响1.1体重的变化：高脂高糖饲养后,大鼠体重增长速度明显快于正常饲养组。T2DM组成模后,大鼠开始消瘦,体重逐渐下降,4w后体重明显低于相同时间段的其他组大鼠的体重(P<0.01)。BBR、MET和B+M组体重有不同程度下降,相互之间差异不显著(P>0.05)。1.2血糖变化：BBR干预后的大鼠和同时期的T2DM大鼠的血糖值相比均有显著下降(P<0.01),4w时血糖下降幅度为25%,8w时下降幅度为43%,12w血糖下降幅度为36%,其降血糖效果以4w最为明显,8w-12w时血糖基本稳定在l0mmol·L-1～12 mmol·L-1水平,降糖作用显著；4w时MET组和B+M组大鼠血糖值低于BBR组(P<O.05),以后这两组血糖下降缓慢。12w时BBR组血糖平均值低于另两个干预组,相互之间差异不显著(P>0.05)。1.3血脂的变化：成模后,血脂逐渐上升,T2DM组12w时血清甘油三酯的浓度增加了近1.6倍；而3个干预组血清甘油三酯浓度的上升明显缓慢,12w时血清甘油三酯的浓度增加了近0.7倍,相互间比较无统计学意义(P>0.05)；T2DM组总胆固醇浓度上升迅速,12w时增加了近3倍；3个干预组血清总胆固醇浓度的上升明显缓慢,12w时增加了近1.3倍,相互间比较无统计学意义(P>0.05)。1.4胰岛素的变化：HFS组血清胰岛素缓慢上升,12w时较初始值上升了30%,CON组血清胰岛素水平基本稳定。成模后,各组血清胰岛素变化明显(P<O.01),平均下降了60%左右。干预后胰岛素水平虽有所上升,但,并不显著,无统计学意义(P>0.05)。1.5胰岛素敏感指数的变化：BBR、MET和B+M组胰岛素敏感指数逐渐上升,至第8w时同T2DM组相比已有显著差异(P<0.05),3个干预组间差异不显著(P>0.05)。HFS组胰岛素敏感指数逐渐下降,CON组胰岛素敏感指数虽有变化,但,不显著。至第12w时同两组相比已有显著差异(P<0.05)。2 BBR对2型糖尿病大鼠肾脏病理变化的影响2.1 PAS染色和体视学测量：同CON组相比,T2DM、MET、B+M和BBR组呈不同程度的阳性反应,T2DM组最重,BBR组最轻,MET和B+M组居中。T2DM和MET组近曲小管上皮细胞内可见数量不等的巨大玫瑰红色糖原颗粒,远端小管上皮细胞肿胀明显,局部胞质呈空泡样变,细胞核溶解消失(oncosis), BBR组近曲小管和远曲小管上皮细胞无明显改变。体视学测量结果显示T2DM组肾小管的体密度明显高于其它3组,肾小管和肾小球囊的基底膜均有不同程度增厚。表明BBR能够明显延缓糖尿病肾脏的病理变化进程。2.2电镜观察结果：T2DM组肾小球基底膜增厚,近曲小管上皮细胞内可见密集的糖原颗粒,远曲小管上皮细胞明显肿胀,,细胞器稀疏,呈空泡化,核膜模糊,染色质集聚靠边。2.3免疫荧光染色检测GLUT4的结果：GLUT4在肾脏近曲小管和远曲小管均有不同程度的表达。光密度分析结果表明BBR组大鼠GLUT4表达最强；B+M组次之；T2DM组最弱；MET组略高于T2DM组。3 BBR对2型糖尿病大鼠心肌保护作用的研究3.1 PAS染色和光密度分析：光镜下CON组心肌纤维排列有序,心肌纤维横纹清晰,细胞核形态正常,心肌细胞内有少量红色颗粒(+)；T2DM组大鼠心肌细胞肥大、心肌纤维排列紊乱,心肌纤维横纹模糊,细胞核淡染,间隙明显增宽,胞质呈紫红色,红色颗粒极密(++++)；BBR组心肌纤维排列整齐,无明显肥大,胞质呈暗红色,红色颗粒较密(+++)。光密度结果显示T2DM组光密度值最大,BBR组光密度值接近于CON组,提示BBR具有降低心肌细胞内糖类物质积聚和改善心肌病理变化的作用。3.2 Western Blot检测GLUT4在心肌的表达水平：BBR、B+M组的GLUT4蛋白表达水平显著高于同期T2DM、MET和CON组(P<O.01),MET组蛋白表达略高于T2DM组和CON组,相互间无统计学意义。4 BBR对2型糖尿病大鼠胰岛素信号传导通路的影响4.1 BBR组大鼠肝脏和骨骼肌P13-K蛋白表达水平随着干预逐渐增强,同T2DM组相比有显著差异(P<O.01)；而MET组P13-K蛋白表达的变化不显著。4.2随着病程的延长,T2DM组肝脏和骨骼肌GLUT4的表达逐渐下降,组间有显著差异(P<0.01);. BBR组GLUT4蛋白表达与同期T2DM和CON组相比均有统计学意义(P<0.05)。提示BBR的降糖作用可能与增强GLUT4的表达水平有关。结论：1.BBR能够显著降低2型糖尿病大鼠的血糖、血脂并能增强胰岛素的敏感性。2.BBR能够延缓2型糖尿病大鼠肾脏病理变化进程,减轻糖类物质在肾小球和肾小管基底膜的沉积,能减轻肾小管上皮细胞的损害程度。3.BBR对心肌具有保护作用,可以减轻心肌细胞内的糖类物质的沉积和纤维结缔组织的增生。4.BBR降低血糖和血脂的效果与MET大致相当,在对糖尿病肾脏和心肌病理变化方面的作用明显优于MET。5.BBR能增强GLUT4、PI3-K在靶组织的表达。