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目的:1.体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定后建立稳定的兔BMSCs体外培养体系,并探讨其成骨分化及骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)的蛋白表达受传统中药三七总皂苷(Panax notoginseng saponin,PNS)的影响。2.研究PNS对BMP-Smad经典信号通路的影响,并在此基础上探讨PNS促进BMSCs成骨分化的作用机制。方法:1.BMSCs体外分离培养、鉴定及成骨能力检测的研究:严格无菌操作下,剥离获取新生新西兰大白兔四肢长骨,然后用含胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和双抗的DMEM冲洗骨髓腔,通过密度梯度离心法、全骨髓贴壁法获取BMSCs后:(1)通过倒置显微镜下观察BMSCs的形态学特点;(2)通过流式细胞术检测BMSCs的表面标志抗原;(3)通过茜素红染色检测细胞内钙结节的形成情况,鉴定兔BMSCs的成骨分化能力。2.PNS对兔BMSCs成骨分化及BMP2蛋白表达的影响:在课题组前期研究的基础上,选用最适浓度(100mg/l)的PNS含药培养基培养兔BMSCs后,采用茜素红染色法检测成骨指标钙结节的形成情况;用免疫细胞化学法分别检测经普通培养基、PNS培养基和成骨诱导培养基培养1周后BMP2蛋白的表达。3.选用最适浓度PNS培养基培养兔BMSCs 3天,6天,12天,设置成骨诱导液组为阳性对照组,普通培养基组为阴性对照组。用免疫荧光法定性检测BMSCs中BMP2、BMPRII,Smad1以及RunX2的定位与表达,通过WB法和qRT-PCR法检测三个不同组诱导3天,6天,12天后BMP2、BMPRII,Smad1以及RunX2蛋白表达与相应mRNA的表达。结果:1.BMSCs体外分离培养、鉴定及成骨能力检测结果:(1)密度梯度离心法分离培养出的兔BMSCs的原代细胞更纯,其种瓶6小时后可见贴壁,呈纤维状集落式生长,48小时后首次换液,7-9天后可见细胞集落扩大并相互融合,达瓶底面积的80%-90%,即可传代,传代后细胞保持着典型的生长方式与形态,镜下见BMSCs的典型形态为长梭形细胞,贴壁生长,整体呈旋涡状排列,形态均一。(2)流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD105(粘附分子)的阳性率分别为83.21%与89.48%,而HLA-DR(成纤维细胞表面标记)的阳性率为5.76%。(3)在成骨诱导基培养下,兔BMSCs可成功向成骨方向诱导,茜素红染色可见阳性钙结节染色。2.在最适浓度的PNS培养基的培养下,兔BMSCs亦可向成骨方向诱导,茜素红染色结果显示PNS组可见钙结节阳性染色,其阳性结果明显强于阴性对照组(P<0.05),但弱于阳性对照组(P<0.05);免疫细胞化学结果显示:在PNS培养液与成骨诱导液培养下,BMP2的染色结果均为强阳性,而普通培养基组的染色结果为阴性。3.免疫荧光显示:BMSCs在细胞质内表达BMP2,在细胞膜上表达BMPRII,在细胞质及细胞核内表达Smad1与RunX2。BMP2、BMPRII、Smad1与RunX2的qRT-PCR结果基本一致,结果显示:3天,6天,12天普通培养基组这四项指标的mRNA表达均无明显变化(P>0.05),而PNS培养基组与成骨诱导组mRNA的表达随着时间逐渐上升(P<0.05),在6天和12天时PNS培养基组与成骨诱导组中该四项指标mRNA的表达均明显高于普通培养基组(P<0.05),在不同的时间点PNS培养基组中这四项指标的mRNA的表达均低于成骨诱导组(P<0.05)。BMP2、BMPRII、Smad1与RunX2的WB检测结果与其qRT-PCR检测结果基本一致。结论:1.PNS可促进兔BMSCs的成骨分化及BMP2的蛋白表达。2.PNS可能通过促进信号因子BMP2的表达、BMP2相应受体的表达以及BMP-Smad经典信号通路的激活,来实现其促成骨作用。