背景和目的慢性牙周炎（Chronic Periodontitis,CP）是由致病微生物引起的一种口腔慢性炎症性疾病,主要表现为牙周支持组织的破坏[1-3],牙周组织包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质。在牙周炎的发病过程中,菌斑微生物及其代谢产物是牙周炎的主要致病因素[4],除了菌斑微生物及其产物对牙周组织造成的直接损伤外,牙周组织在细菌及其产物刺激后所产生的炎症反应也是造成牙周组织损伤的重要因素[5]。牙龈和牙周膜是抵御病菌的屏障,在牙周炎的防御和发生、发展及后期修复中均起着重要作用,牙龈成纤维细胞（Human Gingival Fibroblast,HGF）在牙龈结缔组织中的细胞成分中占绝大多数,成纤维细胞具有合成胶原、基质、弹力纤维和糖蛋白的功能,同时还有吸收胶原和吞噬异物的能力。除此之外,在细菌及其代谢产物的刺激下牙龈成纤维细胞还会产生多种炎症因子,如IL-1β,IL-6及COX2等,从而加重了牙周组织的损伤,在牙周炎的发生、发展中也起着重要的作用[6]。因此本课题选择牙龈成纤维细胞作为体外实验的研究对象。目前临床上除了采取物理方法去除牙菌斑外,必要时还会采用局部或者全身辅助应用抗生素或者非甾体类抗炎药物的方法来抑制炎症反应[7-8]。但这些药物的疗效一般,且长期使用会造成人体菌群失调等副作用,因而在临床使用中受到限制[9]。一些中草药抗炎性能佳,能有效抑制IL-1β和IL-6等炎症因子[10],可调节机体免疫力,并且具有副作用小、资源分布广、成本低廉等特点。从中草药中提取抑制炎症的有效成分已经成为研究治疗牙周炎药物的新途径之一[11-13]。木蝴蝶素A（OroxylinA）是一种具有天然生物活性的黄酮类化合物,分子式为C16H1205,相对分子质量为284.2635。学者发现木蝴蝶素A可显著降低关节炎中IL-1β,IL-6的生成,并可显著降低炎症组织中NLRP3的表达[14-17],进一步研究发现,这种抑制作用是由于抑制NLRP3蛋白的表达和巨噬细胞炎症小体的形成,认为NLRP3炎症小体是木蝴蝶素A抑制关节炎发生发展的作用靶点。也有研究者认为,木蝴蝶素A可以通过抑制ERK/GSK-3β通路来抑制非小细胞肺癌细胞的迁移与侵袭,继而影响其在体内的生长及向肺部转移[18-19]。木蝴蝶素A的功能也体现在调节代谢上,有学者发现木蝴蝶素A通过SCP1/2依赖的SMAD1磷酸化促进成骨分化[20-21],有助于骨关节炎的治疗和恢复。寻找木蝴蝶素A在不同疾病中的作用靶点,对于药物更合理、更高效的使用具有重大意义。关于木蝴蝶素A对牙龈成纤维细胞炎症因子的调节作用及机制的文献报道较少,本课题从体内和体外两个层面进行了研究。第一章对SD大鼠采用丝线结扎下颌第一磨牙牙颈部同时龈沟底局部注射TNF-α的方法建立牙周炎动物模型,探讨了木蝴蝶素A对大鼠牙周炎模型炎症反应的作用;第二章通过建立TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞炎症模型,探讨木蝴蝶素A对炎症状态下人牙龈成纤维细胞的增殖、凋亡及炎症相关因子表达的调节作用;第三章采用RNA-Seq的方法筛选差异木蝴蝶素A作用于人牙龈成纤维细胞的差异基因;第四章对差异基因进行验证分析,对木蝴蝶素A作用于人牙龈成纤维细胞的作用靶点和机制进行初步探讨。材料和方法1.将大鼠分为空白对照组、牙周炎模型组、低浓度木蝴蝶素A组、中浓度木蝴蝶素A组及高浓度木蝴蝶素A组5个组,采用丝线结扎SD大鼠下颌第一磨牙牙颈部,同时龈沟底局部注射TNF-α的方法构建牙周炎动物模型,木蝴蝶素A组为在构建成功的牙周炎模型龈沟内局部注射木蝴蝶素A,观察各组大鼠牙周的变化情况,采用免疫组化的方法对IL-1β,IL-6及COX2在牙周组织中的表达进行定位及半定量分析,Elisa法检测血清IL-1β,IL-6及COX2水平,采用RT-qPCR法及Western-blot蛋白免疫印迹实验检测各组大鼠IL-1 β,IL-6及COX2的基因及蛋白表达水平。2.原代培养HGF,通过TNF-α刺激HGF的方法构建细胞炎症模型,实验组用木蝴蝶素A预处理细胞模型,CCK8实验检测木蝴蝶素A对炎症刺激下HGF细胞增殖的影响,流式细胞术检测木蝴蝶素A对炎症刺激影响下HGF细胞凋亡的影响,RT-qPCR及Western-blot方法检测炎症因子IL-1β,IL-6及COX2的基因及蛋白表达水平。3.将HGF分为空白组（Control）、对照组（Model）及实验组（OroxylinA）三组,采用RNA-Seq技术对三组基因进行转录组测序,富集作用通路并寻找差异基因,寻找木蝴蝶素A的作用靶点。4.对第三部分筛选出来的差异基因在基因和蛋白表达水平方面做进一步的验证,利用基因沉默和过表达技术,进一步研究木蝴蝶素A对炎症细胞模型的作用靶点和作用机制。研究结果1.牙周炎组大鼠牙龈红肿出血、牙龈退缩及牙周袋加深,木蝴蝶素A组牙龈红肿程度减轻,牙周袋深度较牙周炎组减轻（p＜0.05）。HE结果显示牙周炎组大鼠出现附着丧失,实验组的大鼠附着丧失程度减小。免疫组化结果显示IL-1β,IL-6及COX2在不同组别大鼠牙周组织中有不同程度的表达,在模型组大鼠牙龈上皮呈阳强性表达,在实验组大鼠的牙龈上皮中呈弱阳性表达。RT-qPCR及Western-blot显示实验组IL-1β,IL-6及COX2基因及蛋白表达水平较牙周炎组显著降低（p＜0.05）。2.CCK-8结果显示,木蝴蝶素A组在第1天及第2天各浓度组之间细胞增殖活性统计学差异不显著（p＞0.05）,但在实验第3天、第4天及第5天,与对照组相比,100M、200M及300M浓度组细胞增殖活性显著提高,有统计学意义（p＜0.05）;200M浓度组在第4天细胞增值活性达到最高值。流式细胞术检测结果显示,木蝴蝶素A预处理组与牙周炎组比较,HGF细胞凋亡率显著降低（p＜0.05）。Elisa结果显示与牙周炎组比较,实验组的IL-1β,IL-6及COX2蛋白表达显著下降（p＜0.05）。RT-qPCR及Western-blot结果显示实验组的IL-1β,IL-6及COX2mRNA及蛋白表达较牙周炎组显著降低,有统计学意义（p＜0.05）。3.转录组测序结果显示木蝴蝶素A对TNF-α诱导的HGF炎症反应的抑制作用,其机制可能与MAPK信号通路有关,其中基因DUSP5的差异最明显（p＜0.05）。4.木蝴蝶素A+DUSP5沉默组与木蝴蝶素A组比较,IL-1β,IL-6,COX2 mRNA及蛋白表达量均下降,有统计学意义（p＜0.05）。木蝴蝶素A+DUSP5过表达慢病毒组与木蝴蝶素A组比较,IL-1β,IL-6,COX2 mRNA及蛋白表达量均升高,有统计学意义（p＜0.05）。结论1.木蝴蝶素A对大鼠牙周炎模型中的炎症反应有显著的抑制作用。2.木蝴蝶素A预处理对TNF-α诱导HGF产生的炎症因子IL-1β,IL-6及COX2存在显著抑制作用。3.MAPK信号通路在木蝴蝶素A介导的炎症抑制作用中可能发挥着重要作用。4.DUSP5可能是木蝴蝶素A抑制TNF-α诱导的HGF炎症因子表达的作用靶点。创新和意义1.目前关于木蝴蝶素A在口腔领域的研究还十分有限,本课题分别通过体内外实验证实了木蝴蝶素A对TNF-α诱导牙龈成纤维细胞产生的炎症因子有抑制作用。2.牙周炎的调控机制及基因网络复杂,本研究基于RNA-seq测序技术,有针对性地对木蝴蝶素A调控牙龈成纤维细胞炎症因子的作用潜在分子机制进行分析。3.本研究首次提出木蝴蝶素A能调节DUSP5的表达,且DUSP5在TNF-α诱导的HGF炎症因子表达中发挥重要作用,为牙周炎的治疗提供了新的方向。