肺动脉高压（PAH）是一种由于肺血管不正常增生、重构、收缩或血栓形成所导致的肺动脉压力（PAP）和肺血管阻力进行性升高为特点的慢性进展且不可逆性疾病,其临床症状逐渐加重,可致右心功能衰竭甚至死亡,预后性差,死亡率较高,目前已被列为排在冠心病和高血压之后的常见心血管疾病。PAH的传统治疗药物包括抗凝药、利尿药及钙离子拮抗剂等,这些治疗药物仅能改善临床症状,但是不能抑制或逆转PAH疾病的进展。目前一些药物包括前列环素类、内皮素受体拮抗剂类、磷酸二酯酶（PDE）5抑制剂类等在PAH治疗方面有较大进展,均能改善临床症状及血流动力学指标,但仍无法治愈,其死亡率依然居高。随着研究的深入,新型靶向性治疗药物逐渐成为PAH研究领域的热点,包括可溶性鸟苷酸环化酶激动剂、Rho激酶抑制剂、5-羟色胺受体拮抗剂等。本研究采用颈总动-颈内静脉吻合建立左向右分流PAH大鼠模型,这种方法可以通过控制分流量大小来有效控制心肌肥厚及血流动力学改变,模拟临床左向右分流先心病所致早中期PAH。应用鸟苷酸环化酶激动剂利奥西呱对大鼠PAH的早、中期阶段进行干预,通过观察大鼠右心室及肺动脉的压力变化;检测血清和肺组织中内皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）和环单磷酸鸟苷（cGMP）水平;检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、骨桥蛋白（OPN）和整合素β 3蛋白及mRNA含量,在组织学和分子生物学水平从肺血管重构及右心室肥厚的角度去探讨利奥西呱可能的作用机制,为临床上中度PAH患者术前短期应用sGC激动剂降低PAP、改善肺血管重构及右心室肥厚争取手术机会和提高手术成功率,并为临床上药物治疗PAH提供实验和理论依据。第一部分:环磷酸鸟苷和内皮素参与大鼠分流型肺动脉高压心肺功能形态变化目的:本实验通过构建大鼠颈总动脉-颈外静脉分流模型,观测相关的血流动力学变化及功能和形态学病理特征,研究该模型大鼠在颈动-静脉分流3～10周内肺动脉血管重构以及右心室肥厚发展的过程和可能的机制,探讨环磷酸鸟苷和内皮素在分流型PAH心肺功能形态变化中所起的作用。方法:健康SPF级雄性SD大鼠60只,体重180～220g,6周龄,随机分为2组:分流（F）组,假手术（S）组。参照赵科研（2014）等方法构建左向右分流PAH大鼠模型。大鼠麻醉后,仰卧固定,颈部中间切口长约2.0 cm。F组大鼠,显露右侧颈外静脉并结扎远端;右侧颈总动脉,用小血管夹阻断近心端,颈内动脉和颈外动脉分叉处下方约0.5 cm处进行结扎并切断颈总动脉;用小血管夹阻断颈外静脉近心端,在其内侧做一约0.2 cm切口,用8-0滑线行颈动-静脉端侧吻合,松开血管夹出现颈外静脉近心端充盈及搏动性血流,表明吻合口通畅。S组大鼠仅单纯颈部切口,暴露颈总动脉和颈外静脉,分别做结扎不做吻合术。两组动物分别于术后 3,4,6,8,10 周,即 F3、F4、F6、F8、F10 和 S3、S4、S6、S8、S10组,每组6只,测量记录血流动力学指标:右心室收缩压上升最大速率（+dp/dtmax）,右心室收缩压（RVSP）、平均肺动脉压（mPAP）和平均体循环压（mSAP）;心室肥厚相关指标:右心室重量/体重（RV/BW）、（左心室+室间隔）重量/体重[（LV+S）/BW]及右心室肥厚指数=右心室重量/（左心室+室间隔）重量[RV/（LV+S）];血清和肺组织ET-1、NO和cGMP含量;HE染色观察肺动脉病理形态学变化;Masson染色观察右心室纤维化及心肌细胞形态变化。结果:各组大鼠在第3～10周血流动力学变化:F组mPAP、RVSP和+dp/dtmax水平较S组均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;mSAP在第3～6周差异不显著（P＞0.05）,但在第8和10周增加,差异显著（P＜0.05）。大鼠血清中ET-1、cGMP和NO含量测定结果:与S组比较,F组ET-1水平在第3～10周显著升高、NO水平显著降低（P均＜0.01）,cGMP水平在第6～10周显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。肺组织中ET-1、cGMP含量和NO含量测定结果:与S组比较,F组ET-1水平在第4～10周显著升高,cGMP水平在第6～10周显著降低（P＜0.05或P＜0.01）;F组在第3～10周NO水平较S组均显著降低（P均＜0.01）。两组大鼠均无意外死亡,在3～10周内体重随时间变化逐渐增加,且增加趋势一致,没有差异（P＞0.05）。与S组比较,F组RV/BW值在第3～10周显著增加（P＜0.05 或P＜0.01）,（LV+S）/BW值在第 6～10 周显著增加（P＜0.05 或P＜0.01）,RV/（LV+S）在第8、10周显著增加（P＜0.05或P＜0.01）,提示PAH后期右心室肥厚的变化大于左心室。显微镜下S组大鼠肺组织HE染色显示肺动脉管壁较薄,内膜光滑平整,内皮细胞扁平;F组大鼠从第4周开始出现肺动脉血管内膜及中层增厚,同时伴有炎性细胞浸润,表现为内皮细胞轻度增生,胞体由扁平状转变为高柱状且胞核增大,平滑肌细胞增生、排列紊乱,胞核变大;F组较S组大鼠肺动脉管壁增厚,管腔变小,中膜平滑肌层增厚,平滑肌细胞数增多,肌纤维增粗,直径50～150μm肺动脉的WT%和WA%均显著增高（P＜0.01）。显微镜下S组大鼠显示心肌纤维排列整齐,闰盘清晰,肌纤维间胶原组织少;F组大鼠分流4周后出现心肌纤维增粗、排列紊乱、肌纤维间胶原组织增多,分流8周后心肌纤维排列紊乱,闰盘排列不整齐,肌纤维间胶原组织增多明显。F组较S组CVF%均显著增高（P＜0.05或P＜0.01）。结论:本实验结果显示颈总动脉-颈外静脉分流术构建左向右分流大鼠PAH模型可以成功模拟先天性心脏病左向右分流所致PAH早中期病理生理状态;大鼠分流3周后开始出现右心室肥厚,4～8周肥厚加重,并出现左右心室肥厚;PAH早中期病理生理变化与血清和肺组织ET-1、NO和cGMP含量变化有关。第二部分 利奥西呱对左向右分流肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响及机制探讨目的:本研究通过应用颈总动脉-颈外静脉吻合建立分流型PAH模型模拟临床左向右分流先天性心脏病所致的PAH,探讨应用鸟苷酸环化酶激动剂利奥西呱对大鼠PAH的早、中期阶段肺血管重构的影响及可能的作用机制。方法:健康SPF级雄性SD大鼠36只,体重180～220g,6周龄,随机分为假手术组（S组）、分流组（F组）、利奥西呱组（R组）,每组12只。F组和R组行颈总动脉-颈外静脉造瘘手术构建左向右分流PAH大鼠模型,S组处理同第一部分。正常饲养,从第7周开始,R组大鼠每天给予利奥西呱（10 mg/kg）灌胃干预,另外两组大鼠则每天给予生理盐水,连续4周。所有实验组大鼠均在第10周末测定指标。压力测定同第一部分;ELISA方法测定血清及肺组织中ET-1和cGMP含量,Griess方法测定NO含量;HE染色法观察肺小动脉病理形态学改变;免疫组化法测定肺组织α-SMA蛋白的表达,Western blot法测定肺组织中α-SMA蛋白含量;RT-PCR法检测大鼠肺组织α-SMA mRNA表达。结果:各组大鼠血流动力学变化:F组较S组+dP/dtmax、mPAP和RVSP水平均显著升高（P＜0.05）;R组+dP/dtmax、mPAP和RVSP值与F组比较,差异显著（P＜0.05）;各组mSAP比较差异无统计学意义。大鼠血清和肺组织中ET-1、cGMP和NO含量测定结果:与S组相比,F组血清ET-1水平显著均升高,NO和cGMP水平显著降低（P均＜0.01）;与F组比较,R组ET-1水平显著降低,NO水平显著增加,cGMP水平显著增加（P均＜0.05）,并且R组cGMP水平较S组差异不显著,提示利奥西呱干预后可以使大鼠血清和肺组织中cGMP水升高平。Western blot法检测肺组织α-SMA蛋白表达结果:F组较S组α-SMA蛋白表达显著增加（P＜0.05）;R组较F组α-SMA蛋白表达显著降低（P＜0.01）。免疫组化镜下观察:α-SMA蛋白在肺动脉平滑肌细胞上阳性表达物显示棕黄色颗粒。肺组织α-SMA mRNA表达:F组较S组α-SMA mRNA相对含量明显增加（P＜0.05）;R组较F组α-SMA mRNA相对含量明显降低（P＜0.05）。显微镜下肺血管组织HE染色显示:S组肺动脉管壁薄,内膜光滑,内皮细胞扁平;F组肺动脉管壁增厚,管腔狭窄,内膜及中膜增厚,平滑肌细胞增殖,排列紊乱,并伴有炎性细胞浸润;利奥西呱干预后肺组织病理形态改变较F组改善明显。F组和R组WT%和WA%较S组均明显升高（P＜0.05）;R组较F组WT%和WA%分别显著降低（P＜0.05）。结论:利奥西呱可以使PAH大鼠模型体内血清和肺组织中ET-1水平降低,NO和cGMP水平升高,可能与其改变肺血管重构和调节肺动脉压力有关;利奥西呱可能通过抑制肺组织中α-SMA mRNA和蛋白的表达来降低肺血管平滑肌细胞、成纤维细胞的活化增殖,从而抑制肺血管重构。第三部分:利奥西呱对左向右分流肺动脉高压大鼠右心室肥厚的影响及机制探讨目的:应用成功构建的PAH大鼠模型,通过对分流型PAH早中期以及利奥西呱干预下右心室肥厚心肌中骨桥蛋白及心肌细胞表面整合素β 3含量变化,探讨利奥西呱改善右心肌肥厚的可能机制。方法:实验动物及模型制备同第二部分,所有实验组大鼠均在第10周末测定指标。右心室肥厚指标测定:RV/BW、（LV+S）/BW和RV/（LV+S）;Masson染色观察右心室心肌细胞的形态学变化;Western blot法检测右心室心肌组织骨桥蛋白、整合素β 3表达变化;RT-PCR定量检测右心室心肌骨桥蛋白mRNA、整合素β 3 mRNA表达。结果:三组大鼠在3～10周内体重（BW）随时间变化逐渐增加,且增加趋势一致,体重差异不显著（P＞0.05）。实验结束时,测定结果如下:右心室肥厚指标测定结果:F组较S组RV/（LV+S）、RV/BW和（LV+S）/BW 比值显著均升高（P＜0.05）;R组RV/（LV+S）、RV/BW和（LV+S）/BW 比值较F组显著降低（P＜0.05）。Masson染色显微镜下观察:S组大鼠心肌肌纤维排列规整,闰盘清晰,肌纤维间胶原组织较少;F组大鼠心肌纤维明显增粗、排列紊乱,闰盘排列不整齐,心肌纤维间胶原组织增多;R组右心室心肌细胞病理形态学变化较F组明显减轻,心肌结构和纤维粗细介于两者之间。大鼠右心室OPN和整合素β 3蛋白表达结果:F组较S组OPN和整合素β 3蛋白表达显著增加（P＜0.05）,R组较F组OPN蛋白和整合素β 3蛋白表达均显著下降（P＜0.05）。大鼠右心室OPN mRNA和整合素β 3 mRNA表达结果:F组较S组OPN mRNA和整合素β 3 mRNA表达显著增加（P＜0.05,P＜0.01）;R组较F组OPN mRNA表达显著下降（P＜0.05）,但整合素β3 mRNA表达变化差异不显著（P＞0.05）。结论:PAH所致右心室心肥厚与心肌中骨桥蛋白及心肌细胞表面整合素β3含量变化有关;利奥西呱可以降低右心室心肌组织OPN蛋白和mRNA水平,减少心肌纤维化,抑制心肌肥厚和心室重构,改善PAH早、中期右心室收缩功能,有利于改善心肌动力学效应;利奥西呱使右心室心肌组织整合素β 3蛋白表达降低,但整合素β 3 mRNA表达变化不明显。