目的酸浆是经甘薯(或绿豆)淀粉乳自然发酵而形成的,是一种味道偏酸,颜色呈乳白色的液体。在甘薯淀粉的生产过程中加入酸浆,会使淀粉颗粒产生聚集作用而迅速形成团块,因聚集在一起重力作用加大进而加快淀粉与其他杂质的分离速度。在酸浆法生产淀粉过程中使用的酸浆的作用就相当于一种微生物絮凝剂。其在实际生活中有广泛应用。本课题通过自然发酵甘薯酸浆,对其工艺进行研究,确定自然发酵甘薯酸浆的工艺和絮凝作用菌,分离纯化出发酵酸浆中优势作用菌。采用响应面分析8种培养基成分和培养温度、pH值、培养时间和接菌量对菌种生长的影响,确定其最佳培养条件。采用单因素实验和正交实验分析不同接菌量、金属离子对甘薯淀粉絮凝条件的影响。分析不同的离心转数和保护剂对酸浆制备的冻干粉絮凝作用的影响。采用超声提取法和盐酸胍提取法提取副干酪乳杆菌淀粉结合蛋白,分析起絮凝作用的活性物质,确定其分子质量。本实验为提高淀粉制品的质量与产量以及今后微生物絮凝剂的深入研究提供理论基础和技术支撑。方法1、采用自然发酵甘薯酸浆,测定不同时间条件下(12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h)酸浆的pH值和絮凝率。通过宏基因组技术分析自然发酵甘薯酸浆中的微生物区系,鉴定优势作用菌,研究上清和沉淀中的DNA质量及Alpha多样性,对其丰度进行分析。2、选择培养基成分包括碳源,氮源,及培养时间,培养温度,初始pH值和接菌量等因素,通过响应面分析,以絮凝率作为评价指标,获得菌种最佳培养条件。3、通过单因素实验和正交试验,在确定菌种最佳培养条件的基础上,以不同金属离子、接菌量、初始pH值为考察因素,分析新鲜甘薯浆中不同金属离子、接菌量、初始pH值对菌种絮凝甘薯淀粉活性的影响,确定副干酪乳杆菌的最佳絮凝条件。4、对自然发酵的酸浆进行离心,真空冷冻干燥,制备自然发酵酸浆冻干粉,分析2000r/min、3000r/min、4000r/min、5000r/min条件下酸浆的离心状态,考察不同处理条件包括10%甘油、10%浓度蔗糖、10%浓度脱脂乳液与空白管进行对照,测定不同保护剂得到的冻干粉的絮凝率及保存时间对冻干粉活力的影响。以采用不同的方法提取菌体絮凝作用蛋白,包括超声破碎提取法、盐酸胍提取法,结合前期研究,进行电泳操作,分析絮凝物质的分子量,及不同蛋白对絮凝起到的作用。结果1、在酸浆发酵的不同时间,其pH值不同,呈现逐渐下降的趋势,在12h时pH值最高,达到4.18,在絮凝率最高时pH值为3.62,在第四天时继续下降达到3.35。酸浆的絮凝率呈现先上升后下降的趋势,在培养时间70h左右出现最高絮凝率,达到最佳絮凝率69.23%时pH值为3.62,在10h左右即刚刚活化时絮凝率最低。酸浆中菌种是由短状杆菌组成的链状,而不是单个的杆状。甘薯淀粉在自然状态下是均匀分布的而添加酸浆后的甘薯淀粉在显微镜下聚集在一起,形成团状,在量瓶中可以肉眼看出大块的雪花状沉淀,并迅速沉降下来。自然发酵甘薯酸浆的上清和沉淀的V4区共有效序列118465条,优质序列93295条,确定自然发酵甘薯酸浆中主要作用菌为副干酪乳杆菌,其属于变形菌门,上清样品的丰富度指数(Chao/Ace)为598.94/463.62,沉淀样品的丰富度指数为583.85/421.20。2、通过PB实验设计和响应面分析确定三个显著因素分别为葡萄糖添加量、K2HPO4添加量和温度。最后确定副干酪乳杆菌的最佳培养条件为:作为碳源的葡萄糖最佳添加量为26g/L、提供微生物生长离子环境的K2HPO4的最佳添加量为8g/L、最佳培养温度为31℃,此时微生物的絮凝率最高为74.39%。3、确定对絮凝率影响最大的因素为接菌量,其次分别为pH值和金属离子,并在接种量为15%、pH值为5.5、Na+为1ml时絮凝率最高,絮凝率为76.03%,但考虑到添加金属离子的成本问题将其确定为非重要决定因素。4、自然发酵甘薯酸浆的絮凝率为76%左右,对其进行冻干后的有所下降,不添加保护剂的空白管为38.27%。而添加保护剂的冻干粉中,以蔗糖为保护剂的冻干粉絮凝率最高,为59.27%,其次为脱脂乳为52.14%,以甘油为保护剂的冻干粉絮凝率为45.25%。随着时间的增加,冻干粉的絮凝率有所下降,但下降趋势平缓。用两种方法提取的副干酪乳杆菌淀粉结合蛋白进行SDS-PAGE后,可以看出超声提取法提取蛋白在35-48k Da之间,盐酸胍法提取菌体蛋白在30-50k Da之间,质谱分析菌体有六十多种蛋白,其中有八种蛋白对絮凝作用有显著影响,影响最显著的为细胞壁水解酶。结论自然发酵出的甘薯酸浆效果较好,确定起絮凝作用的菌种是副干酪乳杆菌,利用PB实验设计和响应面分析确定菌种最佳培养条件为:葡萄糖最佳添加量为26g/L、K2HPO4的最佳添加量为8g/L、最佳培养温度为31℃,此时微生物的絮凝率为74.39%。通过单因素实验和正交实验确定的最佳絮凝条件为:接种量为15%、pH值为5.5,此时絮凝率为76.03%。制得的自然发酵酸浆冻干粉絮凝效果有所下降,蔗糖为保护剂效果最好。在保存四个月后活力在50%左右。最终提取菌体蛋白在30-50k Da之间,其中有八种蛋白对絮凝作用有显著影响,影响最显著的为细胞壁水解酶。