人参皂苷Rg1对棕榈酸钠诱导的肾小球系膜细胞纤维化的改善作用及机制

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第一部分目的:研究棕榈酸钠(palmitate,PA)、高糖(high glucose,HG)以及棕榈酸钠联合高糖对人肾小球系膜细胞(human glomerullar mesangial cells,HMCs)纤维化的作用及其机制,并探究氧化应激和MAPK通路磷酸化对HMCs细胞纤维化的影响。方法:HMCs细胞分组如下:(1)用不同浓度的PA(40,80,160,320μmol/L)处理细胞24h,并设置对照组;油红染色观察细胞内脂质沉积情况;H2DCFDA检测细胞内ROS表达情况;(2)分为对照组、PA、HG、PA+HG组。除了油红染色和ROS外,活细胞成像检测细胞形态的变化;免疫荧光法观察胶原Ⅳ(Col4)蛋白的表达;Real-time PCR检测Col4、TGF-β和FN表达;Western blot测定HMCs细胞内p22phox、p47phox、NOX4、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38、TGF-β、FN蛋白表达情况。结果:油红染色结果显示,与对照组比较,PA浓度(40,80,160,320μmol/L)增加会使细胞中的脂质沉积逐渐增加。活性氧结果显示,与对照组比较,PA浓度(40,80,160,320μmol/L)增加会使细胞中ROS水平明显增加。活细胞成像结果显示,与对照组比较,PA、HG、PA+HG组能够改变HMCs细胞形态;油红染色结果显示,与对照组比较,HG组未发现明显脂质沉积,PA、PA+HG组细胞脂质沉积增加;与PA组比较,PA+HG组细胞脂质沉积增加,但差异无统计学意义。活性氧结果显示,与对照组比较,PA、HG、PA+HG组细胞中ROS水平明显增加;与PA组比较,PA+HG组细胞ROS水平增加,但差异无统计学意义。免疫荧光显示,与对照组比较,PA、HG、PA+HG组Col4蛋白的表达均会增加;与PA组比较,PA+HG组Col4蛋白的表达增加。PCR结果显示,与对照组比较,PA、HG、PA+HG组细胞中TGF-β和FN的m RNA表达明显增加;与PA组比较,PA+HG组TGF-β和FN的m RNA的表达增加。WB结果显示,与对照组比较,ERK、JNK、P38蛋白的表达无明显变化,PA、HG、PA+HG组细胞中p22phox、p47phox、NOX4、p-ERK、p-JNK、p-P38、TGF-β、FN蛋白的表达明显增加;与PA组比较,PA+HG组p22phox、p-JNK、FN蛋白表达增加。结论:棕榈酸钠单独或者联合高糖均能诱导HMCs细胞纤维化,脂质沉积明显,细胞内ROS生成增加,MAPK通路磷酸化水平增加,但棕榈酸钠联合高糖协同作用不明显,表明棕榈酸钠在HMCs细胞纤维化中占据主要作用。第二部分目的:研究氧化应激和MAPK通路磷酸化在PA诱导的HMCs细胞纤维化中的作用,并探究人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,Rg1)改善HMCs细胞纤维化的作用及机制。方法:HMCs细胞分组如下:对照组、PA组、Rg1(5、10μmol/L)给药组、Apocynin(50μmol/L)给药组。活细胞成像检测细胞形态的变化;油红染色观察细胞内脂质沉积情况;H2DCFDA检测细胞内ROS表达情况;免疫荧光法观察Col4蛋白的表达;Real-time PCR检测Col4、TGF-β和FN表达;Western blot测定HMCs细胞内p22phox、p47phox、NOX4、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38、TGF-β、FN蛋白表达情况。结果:活细胞成像结果显示,与对照组比较,PA组能够改变HMCs细胞形态,与PA组比较,Apocynin和Rg1(5、10μmol/L)能够逆转细胞形态的改变。油红染色显示,与对照组比较,PA组细胞脂质沉积明显增加,与PA组比较,Apocynin和Rg1(5、10μmol/L)给药后能够明显减少HMCs中的脂质沉积。活性氧结果显示,与对照组比较,PA组明显增加了细胞中ROS水平,与PA组比较,Apocynin和Rg1(5、10μmol/L)明显降低了HMCs细胞中ROS的生成。免疫荧光结果显示,与对照组比较,PA组会增加细胞中Col4蛋白的表达,与PA组比较,Apocynin和Rg1(5、10μmol/L)明显降低了HMCs细胞中Col4的表达。PCR结果显示,与对照组比较,PA组会增加细胞中TGF-β和FN的m RNA表达,与PA组比较,Apocynin和Rg1(5、10μmol/L)明显降低了HMCs细胞中TGF-β和FN的m RNA表达。WB结果显示,与对照组比较,PA组会增加细胞中p22phox、p47phox、NOX4、p-ERK、p-JNK、p-P38、TGF-β、FN蛋白的表达,ERK、JNK、P38蛋白的表达无明显变化,与PA组比较,Apocynin和Rg1(5、10μmol/L)明显降低p22phox、p47phox、NOX4、p-ERK、p-JNK、p-P38、TGF-β、FN的表达。结论:人参皂苷Rg1可能通过降低氧化应激反应,减少MAPK通路相关蛋白的磷酸化,从而减轻HMCs细胞的纤维化。
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