第一部分：免疫负调控分子TIPE2在慢性乙型肝炎、肝硬化和原发性肝癌患者中的表达规律研究研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染是我国病毒性肝炎的主要原因。HBV急性感染后,约90%成年感染者具有自限性,通过自身免疫可以清除；若机体免疫功能不全,乙肝病毒高度复制以及对感染肝细胞呈现免疫耐受状态,可发展为慢性肝炎。慢性乙型肝炎若不加以有效控制,反复炎症可导致肝脏纤维化,进而发展为肝硬化(Liver cirrhosis, LC)口肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)等严重并发症,危害我国人民生命健康。慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌是慢性HBV感染进程中的“三部曲”,也是我国病毒性肝炎防治领域的重要疾病。通常认为,宿主免疫因素是影响HBV感染转归的决定因素,免疫功能紊乱在慢性HBV感染患者的疾病进展中发挥重要作用。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2 (Tumor necrosis factor-a induced protein 8 like 2,TIPE2)是美国宾夕法尼亚大学陈有海教授2008年在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中发现的一个重要免疫负调控分子,是体内维持免疫动态平衡的必须蛋白之一。TIPE2基因可有效控制炎症反应,TIPE2基因敲除小鼠在8周龄时就表现出多器官自身免疫病症状,体内持续存在高浓度的多种炎症介质(IL-1,IL-6,IL-10,IL-12,IFN-γ,TNF-a等);TIPE2基因敲除的小鼠巨噬细胞对Toll样受体介导的刺激表现出持续强烈的应答,产生多种显著高于正常水平的炎症因子；向巨噬细胞转入TIPE2基因,使之高表达,则可抑制Toll样受体介导的反应。TIPE2基因还可负调控NF-κB和AP-1信号通路,调控CD8+T和CD4+T淋巴细胞的活化和多种炎症介质产生。结构生物学分析提示在TIPE2蛋白结构中,其死亡效应结构域(Dead Effort Domain, DED)与传统的DED结构域呈镜像关系,这种独特结构预示TIPE2可能还具有目前未知的免疫自稳机制。目前,TIPE2在免疫自稳、免疫性疾病及炎症介质反应等病理过程中的作用和意义逐渐明了。在HBV感染方面,有学者利用TIPE2基因敲除小鼠,构建了HBV感染模型,初步发现TIPE2基因可能参与人和小鼠中乙型肝炎的发病机制。我们在早期研究中,采用实时荧光定量RT-PCR技术,检测了慢性乙型肝炎患者和慢加急性肝衰竭患者外周血TIPE2 mRNA的表达水平,发现慢性乙肝患者TIPE2基因比健康对照组患者明显升高,而在慢加急性肝衰竭患者TIPE2 mRNA的上调较为明显,提示TIPE2参与乙型肝炎的免疫发病机制。然而,也有少量研究提示TIPE2mRNA在慢性乙型肝炎中的表达比健康对照组下降。造成这种分歧的原因,考虑与临床样本的选择和样本量大小等因素有关,部分免疫反应低下患者可表现为TIPE2表达的下降,而部分过强免疫反应的患者也可表现为TIPE2的反馈性增加。此外,我们还不清楚TIPE2 mRNA在肝硬化和肝细胞癌患者中的表达情况,国内外尚未见有关报道。因此,TIPE2在慢性HBV感染进程中的表达规律及临床意义,仍需进一步阐明。研究目的探讨慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌患者外周单个核细胞中TIPE2mRNA的表达规律,以及其TIPE2 mRNA与临床指标的相关性。研究方法本研究采用横断面研究设计,采用随机的方法纳入慢性HBV感染患者193例,其中慢性乙型肝炎患者97例,肝硬化患者55例,肝细胞癌患者41例,均为2013年12月至2014年5月间在山东大学齐鲁医院肝病科住院或门诊患者。此外,选择14例成年健康志愿者作为正常对照。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)方法检测所有患者及健康对照外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)中TIPE2 mRNA表达水平。研究结果1.慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平明显高于健康对照组(均P<0.05)。与肝硬化患者相比,慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞T IPE2 mRN A表达水平无明显差异(P>0.05)。肝细胞癌患者外周血单个核细胞TIPE2 ml NA表达水平明显低于健康对照组(P<0.01)。2.在慢性乙型肝炎患者,HBVDNA阳性患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平明显高于HBVDNA阴性患者(P<0.05)。Spearman秩和相关分析结果表明,慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中TIPE2 mRNA表达水平与血清ALT水平、血清AST水平和血清PTA水平均呈明显正相关(r=0.262,P<0.05；r=0.292,P<0.05；r=0.207,P<0.05),而年龄、白蛋白、胆红素、凝血酶原时间、乙肝病毒载量与TIPE2 mRNA表达水平无明显相关(均P>0.05)。3.在乙肝肝硬化患者,代偿期患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平明显低于失代偿期患者(P<0.05),腹水阳性患者外周血单个核细胞中TIPE2mRNA表达水平明显高于腹水阴性患者(P<0.05)。肝硬化患者外周血单个核细胞中TIPE2 mRNA表达水平与胆红素和MELD积分呈明显正相关(r=0.288,P<0.05；r=0.366,P<0.01)。4.在肝细胞癌患者,外周血单个核细胞TIPE2 mRNA的表达水平与是否有血管浸润、肿瘤大小以及TNM分期有显著相关性,且与AFP呈明显负相关(r=0.312,P<0.05)。结论慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平比健康对照组明显升高,而肝细胞癌患者TIPE2 mRNA表达水平比健康对照组明显降低。TIPE2 mRNA表达与慢性乙型肝炎患者肝脏损伤、肝硬化病情轻重明显相关,而与肝细胞癌的肿瘤分期也密切相关。这些结果表明,TIPE2基因参与慢性HBV感染的不同进程,在不同的疾病状态可能具有不同的生物学作用。第二部分：免疫负调控分子TIPE2在慢性乙型肝炎临床免疫分期中的表达研究研究背景乙型肝炎病毒感染严重威胁人类健康,据估计全世界大约有3.5-4.0亿人为慢性HBV携带者。HBV急性感染后,若机体免疫功能不全,可发展为慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)。慢性乙型肝炎的自然病史是一个动态过程,根据宿主免疫反应的不同可将慢性乙型肝炎的自然史分为四个阶段：(1)免疫耐受(Immune tolerant, I T)期：特征是HBeAg阳性、HBV高水平复制、血清转氨酶正常或低水平、轻微或无肝脏炎症坏死,无或缓慢的肝纤维化进展；(2)免疫清除(Immune clearance, IC)期：特征是HBeAg阳性、与免疫耐受期比较相对较低水平的病毒复制、血清转氨酶水平升高或处于波动、中或重度肝脏炎症坏死；(3)低复制(Low or no-repliicative, LR)期：特征是HBeAg阴性、血清HBVDNA水平非常低或检测不到、血清转氨酶正常；(4)再活动期：特征是HBeAg阴性、HBV DNA转氨酶水平周期性波动和活动性肝炎,再活动期主要表现为HBeAg阴性状态下的肝脏炎症,也被称为HBeAg阴性的慢性乙型肝炎(HBeAg Negative Hepatitis, ENH)。免疫耐受期和低复制期为相对稳定的状态,一般不需要进行抗病毒治疗。而免疫清除期和再活动期为免疫激活状态,此时机体免疫系统启动清除病毒过程,肝脏反复炎症,需要进行抗病毒治疗。然而,目前对于机体清除病毒的机制亦不十分清楚,主要认为与细胞免疫病理损伤有关,机体免疫功能紊乱可导致HBV不能有效清除。因此,正确了解慢性乙型肝炎自然病史发展过程中的免疫功能和机制对彻底清除病毒至关重要。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(Tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2, TIPE2)是最近发现的一种新型的免疫负调控分子,具有调节免疫反应的作用,对维持机体免疫系统的自我稳定具有重要的调节作用。近年来的研究逐渐表明,TIPE2的表达与慢性乙型肝炎的发病具有一定的关系,但其具体机制仍不明确。我们在研究中发现,慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平比健康对照组较高,但也有部分研究报道了相反的结果。究其原因,在纳入慢性乙型病毒性肝炎患者时,并没有对慢性乙型肝炎患者的免疫分期进行有效区分,而不同免疫状态存在免疫反应的巨大差别,存在较大的选择偏倚。此外,样本量较小也是一重要影响因素。鉴于此,我们在早期研究工作基础上,进一步扩大慢性乙型肝炎患者的样本量,区分为不同的临床免疫阶段,分析慢性乙型肝炎患者不同免疫阶段TIPE2及其相关炎症因子的动态表达规律,进一步揭示慢性乙型肝炎的免疫机制。研究目的1.探讨慢性乙型肝炎不同临床免疫分期患者外周血单个核细胞内TIPE2及其相关炎症因子包括白介素(Interleukin,IL)-6、IL-10、干扰素(Interferon, IFN)-γ和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)-a基因表达水平的变化规律。2.探讨在慢性乙型肝炎患者肝组织中TIPE2蛋白的表达情况。研究方法本研究采用回顾性方法共纳入205例慢性乙型肝炎患者,包括免疫耐受期患者40例,免疫清除期患者100例,低复制期患者28例和再活动期患者37例,15例健康志愿者作为正常对照。我们采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)方法检测慢性乙型肝炎患者和健康对照组外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中 TIPE2、IL-6、IL-10、IFN-y和TNF-a基因表达水平。另外,我们还收集了25例行经皮肝穿刺活检的慢性乙型肝炎患者及5例健康肝移植供者的肝组织标本,采用免疫组织化学方法检测TIPE2在肝组织内的表达情况。研究结果1.慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平比健康对照组明显升高(p<0.05),IL-6、IL-10和TNF-amRNA表达水平较健康对照者明显升高,而IFN-ymRNA水平与健康对照组无明显差异(P>0.05)。2.免疫清除期患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平明显高于再活动期患者(P<0.05),低复制期患者TIPE2 mRNA表达水平明显高于免疫耐受期患者(P<0.05)。再活动期患者TIPE2 mRNA表达水平与免疫清除期患者相比,无显著性差异(P>0.05),低复制期患者TIPE2 mRNA表达水平和免疫耐受期组相比较无明显差异(P>0.05)。3.免疫清除期患者外周血单个核细胞IL-10 mRNA表达水平明显高于低复制期患者(P<0.05),免疫清除期患者IL-10 mRNA表达水平与免疫耐受期患者相比较明显升高(P<0.05)。同时,免疫耐受期患者外周血单个核细胞IL-10mRNA表达水平明显低于再活动期患者(P<0.05)。Kruskal-Wallis分析提示外周血单个核细胞IL-6、TNF-α和IFN-γmRNA表达水平在慢性乙型肝炎不同临床免疫分期中无明显差别。4.外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平区分免疫耐受期和免疫清除期的受试者工作特征曲线下面积(AUROC)为0.765(95%可信区间为0.686-0.832,P<0.001),当选择T IPE2 mRNA最佳截断值为2.02时,诊断敏感性为66%,特异性为87.5%；外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达水平区分再活动期组和从低复制期的AUROC为0.751(95%可信区间为0.628-0.850,P<0.001),当选择TIPE2 mRNA最佳截断值为1.59时,诊断敏感性为89.19%,特异性为67.86%。5.免疫组织化学分析提示慢性乙型肝炎患者肝组织中TIPE2蛋白主要表达于肝细胞的细胞质中,TIPE2蛋白表达随着肝组织炎症分级和肝纤维化分期加重而增加。6. Spearman秩和相关分析结果表明,慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中TIPE2 mRNA表达水平与血清ALT水平、血清AST水平和血清PTA水平均呈明显正相关(r=0.300,P<0.001；r=0.283,P<0.001；r=0.218,P=0.002),与IL-6、TNF-αIFN-γ,呈明显负相关(r=-0.163,P<0.001；r=-0.159,P=0.023；r=-0.183,P=0.009)。慢性乙型肝炎患者TIPE2 mRNA表达水平与IL-10呈明显正相关(r=O.147,P=0.036)。结论慢性乙型肝炎免疫清除期和再活动期患者患者外周血单个核细胞TIPE2mRNA水平明显升高,TIPE2 mRNA表达水平与疾病免疫分期和炎症程度密切相关。TIPE2蛋白主要在肝细胞细胞质表达,与肝组织炎症程度和纤维化分期密切相关。综上所述,TIPE2在慢性乙型肝炎患者的自然病史中发挥重要作用。第三部分：外周血单个核细胞TIPE2 mRNA作为分子标志物评估慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后的诊断价值研究研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-Chronic Hepatitis B Liver Failure, ACHBLF)是在慢性乙型肝炎病毒感染的基础上发生的急性肝功能失代偿,主要表现为凝血功能障碍和高胆红素血症,常伴有肝性脑病和腹水等并发症。慢加急性乙型肝炎肝衰竭是我国肝衰竭的最常见类型,该病病程凶险,死亡率高,临床预后极差。目前临床上缺乏有效、特异性治疗手段,肝移植是治疗慢加急性乙型肝炎肝衰竭的最有效治疗。但由于肝脏供体的限制,肝移植并不能普及,仅仅能够一小部分患者生命。建立有效和特异的肝衰竭预后评估系统对于降低肝衰竭的死亡率具有重要意义。目前,国内外有20多种肝衰竭的预后评估体系,终末期肝病积分(Model for end-stage liver diseases, MELD)是目前最常用的肝衰竭预后评估系统。但由于国内外疾病谱的差异,这些评估系统多建立在酒精或药物导致的肝衰竭基础之上,而对于乙型肝炎所导致的慢加急性肝衰竭预后评估的诊断价值则不甚理想。因此,建立符合我国国情的、乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭的预后评估体系具有重要的现实意义。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2 (Tumor necrosis factor-a-induced protein 8-like 2, TIPE2)是最近发现的一种新型的免疫负调控分子,可负性调节Toll样受体介导的免疫反应和T细胞受体介导的细胞免疫反应。我们前期的研究表明慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血单个细胞中TIPE2 mRNA的表达与病情严重程度密切相关,小样本临床观察也发现外周血单个核细胞TIPE2 mRNA在肝衰竭死亡组和生存组间存在明显差异,这些结果提示了TIPE2 mRNA作为分子标志物用于肝衰竭预后的可能性。因此,我们利用慢加急性乙型肝炎肝衰竭前瞻性研究队列,根据时间序列分为模型组和验证组,评估外周血单个核细胞TIPE2mRNA作为分子标志物评估慢加急性肝衰竭临床预后的诊断价值。研究目的1.进一步探讨慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血单个核细胞中TIPE2 mRNA的表达规律,以及TIPE2 mRNA与慢加急性乙型肝炎肝衰竭病情严重程度关系；2.评估外周血单个核细胞TIPE2 mRNA作为分子标志物评估慢加急性肝衰竭临床预后的诊断价值研究方法本研究采用前瞻性研究方法共纳入171例慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者,为2009年3月至2014年12月在山东大学齐鲁医院肝病科住院患者。根据时间序列不同,将171例慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者分为两组：2009年3月至2013年5月就诊的108例患者作为模型组；2013年6月至2014年12月就诊的63例患者作为验证组。本研究还纳入22例健康对照和42例慢性乙型肝炎患者作为临床对照。我们首先通过密度梯度离心法提取研究对象外周血单个核细胞,Trizol提取总RNA,采用RT-PCR法检测外周血单个核细胞中TIPE2 mRN A的表达水平。首先采用单因素分析确定临床指标与肝衰竭预后的相关关系,取单因素分析P值具有统计学意义的临床指标纳入多因素COX比例风险模型,用于鉴定影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者临床预后的独立危险因素。采用受试者工作特征曲线评估模型组和验证组外周血单个核细胞TIPE2 mRNA和MELD积分预测慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者预后的诊断价值。研究结果1.我们对ACHBLF患者进行了6个月的随访,由于在随访的4个月到6个月期间无患者死亡,因此我们采用3个月生存率评价慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者预后。慢加急性肝衰竭患者3个月死亡率为62%,常见并发症肝硬化、肝性脑病、腹水和自发性腹膜炎各占为59例(54.6%),39例(36.1%),50例(46.3%)和40例(37%)。2.模型组慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者TIPE2 mRNA表达水平明显高于慢性乙型肝炎患者(P<0.001)和健康对照组(P<0.001)。在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中,死亡组外周血单个核细胞TIPE2mRNA表达水平明显高于存活组患者(P<0.001)。Spearman秩和相关分析结果表明,TIPE2 mRNA表达水平与MELD积分、HBsAg呈明显正相关(r=0.544,P<0.001：r=0.229,P<0.05)；与PLT呈明显负相关(r=-0.262,P<0.05)。3.单因素COX比例风险模型分析结果提示,白蛋白(HR=0.948,95% CI：0.906-0.993,P<0.05),白细胞(HR=1.045,95% CI：1.015-1.076,P=0.003),肝硬化(HR=1.977,95%CI：1.199-3.263,P=0.008),自发性腹膜炎(HR=3.052,95%CI：1.875-4.967,P<0.001),腹水(HR=1.855,95%CI:1.141-3.017,P<0.05),肝性脑病(HR=3.353,95%CI:2.062-5.453, P< 0.001), MELD积分(HR= 1.093,95%CI:1.052-1.136,P<0.001)和TIPE2 mRNA (HR= 1.202,95% CI:1.140-1.267,P<0.001)是影响患者预后的重要因素。4.多因素COX比例风险模型分析提示白细胞(HR=1.058,95%CI:1.023-1.095, P=0.001)、自发性腹膜炎(HR=2.541,95%CI:1.378-4.686,P=0.003),肝性脑病(HR=1.848,95%CI:1.028-3.321, P=0.040), MELD积分(1.062,95%C1: 1.009-1.118, P=0.021),和TIPE2 mRNA (HR= 1.081,95% CI:1.009-1.159,P=0.027)是影响患者预后的独立危险因素。5. TIPE2 mRNA预测ACHBLF患者3个月死亡率预后的受试者工作特征曲线下面积(Aera under receiver operatingcharacteristic curve,AUROC)为0.849(SE0.0360,95% CI 0.767-0.911)明显优于MELD积分0.722(SE 0.0484,95% CI 0.6280.804,P<0.005)。当TIPE2 mRNA选用预测慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者预后的最佳诊断截点6.54时,诊断灵敏性74.63%,特异性90.24%,阳性预测值92.5%,阴性预测值67.3%。当MELD积分选用最佳诊断截点24.64时,诊断灵敏性71.64%,特异性68.29%,阳性预测值78.7%,阴性预测值59.6%。6.模型组中TIPE2 mRNA和MELD积分联合的AUROC为0.853(SE 0.0357,95%CI：0.772-0.914),明显优于MELD积分。验证组中TIPE2和MELD积分联合的AUROC为0.909(SE 0.0375,95% CI 0.810-0.967)明显优于MELD积分(P=0.0004)。结论外周血单个核细胞TIPE2 mRNA可作为分子标志物用于诊断慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后,比MELD积分具有更高的诊断准确率,TIPE2还可有效地提高MELD积分单独预测慢加急性肝衰竭预后的诊断价值。