芹菜（Apium.graveolens L.）从15世纪由高加索传入中国。古代本草记载与现代研究文献都证明芹菜具有降血压、镇静、健胃、利尿、润肺等药用功效。在七十年代,国内外学者开始对芹菜及其相关化合物的体内代谢过程进行了研究。芹菜黄酮类化合物的分离纯化与药理功能研究是目前芹菜资源高效利用研究的热点之一。但是,由于芹菜品种的黄酮类物质含量差异大,提取产品纯度低,功能成分与药理不明确等问题严重制约了芹菜资源的开发利用。因此,研究芹菜资源黄酮类物质含量的差异特点,建立芹菜黄酮类物质提取、分离、纯化新工艺与分析方法,解析芹菜黄酮类物质的结构特征,研究其药理功能均具有重要的理论与实际意义。本研究建立和完善了芹菜总黄酮、芹菜素、芹菜苷含量的分析方法,分析测定了湖南不同基因型芹菜的黄酮类含量,采用色谱技术建立了芹菜黄酮的特征图谱。优化了芹菜黄酮乙醇提取技术参数,建立了芹菜黄酮苷单体树脂纯化制备的优化工艺。通过大孔树脂、聚酰胺树脂、葡聚糖凝胶柱色谱分离技术和高速逆流色谱分离技术,分离纯化获得了芹菜黄酮单体成分。通过¹H NMR,¹³C NMR,UV,IR和MS表征,鉴定了芹菜黄酮类化合物的单体结构。通过细胞学、分子生物学方法研究了芹菜黄酮粗提物及单体成分在抑制肝癌细胞和白血病细胞、降血脂、降血压等方面的药理活性,为芹菜资源的深度开发提供了重要的理论依据和技术支撑。本文的主要研究结果如下:1芹菜黄酮类物质分析方法的建立建立和完善了Al（NO₃）₃络合分光光度法测定芹菜中总黄酮的含量。以芦丁为标准样品,在500nm波长处得到标准曲线回归方程:C=0.9967A+0.0178,R²=0.992。精密度、显色稳定性、重复性和回收率评价试验中相对标准差（RSD）分别为0.34%、1.11%、2.38%、1.98%。建立了芹菜中芹菜素含量的HPLC分析法。采用Kromasil C₁₈（4.6mm×150mm,i.d.,5μm）色谱柱,乙腈-水（35:65）为流动相,1.0mL/min流速,35℃柱温,10μL进样量,UV检测器,270nm波长检测。芹菜素的最低检出限为18ng/mL。稳定性、精密度、重复性和回收率的评价试验中相对标准差（RSD）分别为0.93%、0.93%、1.08%、1.91%。建立了芹菜醇提物中芹菜素含量的HPTLC测定法。采用G₆₀硅胶板（10cm×10cm）和氯仿-甲醇-水（18:2.3:0.35）为展开剂,以氘灯和钨灯为光源,在345nm波长下,单波长反射法吸收扫描,扫描速度5mm/s,狭缝5.00×0.30mm,扫描时间3min。稳定性、精密度和回收率评价试验中,相对标准偏差RSD分别为0.25%、1.33%、1.81%。HPTLC方法在30min内稳定性良好,精密度好,回收率高。建立了芹菜中芹菜黄酮苷和3′-甲氧基芹菜苷含量的HPLC测定法。采用ODS C₁₈（4.6mm×150mm,i.d.,5μm）色谱柱,乙腈-水（23:77）为流动相,0.6mL/min流速,40℃柱温,紫外检测器,270nm波长检测,10μL进样量。芹菜苷和3′-甲氧基芹菜苷的最低检测限分别为42ng/mL和46ng/mL。芹菜苷分析的精密度、稳定性、重复性和回收率试验中,相对标准差（RSD）分别为1.4%、2.1%、3.1%和1.6%。3′-甲氧基芹菜苷分析的精密度、稳定性、重复性和样品回收率试验中,相对标准差RSD分别为4.5%、2.1%、3.0%和0.8%。2湖南不同基因型芹菜黄酮类物质的测定与色谱特征采用分光光度法和HPLC法测定了17个芹菜品种（16个湖南地方品种,1个引进品种）中黄酮类物质含量,并建立了芹菜素和芹菜苷的色谱图。湖南不同产地芹菜叶（干重）总黄酮含量为1.541～20.350mg/g,芹菜叶柄（干重）总黄酮含量为0.744～4.743mg/g,其中,张家界野芹菜叶黄酮含量最高,达到20.350mg/g,邵阳实芹叶黄酮含量最低,为1.541mg/g。芹菜叶中芹菜素含量在0.02～0.88mg/g之间,叶柄中芹菜素含量在0.03～0.59mg/g之间。芹菜叶中芹菜苷、3′-甲氧基芹菜苷含量分别为1.2～4.3mg/g和0.6～1.9mg/g。芹菜叶柄中芹菜苷、3′-甲氧基芹菜苷含量分别为0.1～0.4mg/g和0.1～0.3mg/g。张家界实芹叶的芹菜苷和3′-甲氧基芹菜苷含量最高,分别为4.3mg/g和1.9mg/g,而张家界野芹菜、长沙水芹菜中未检出。湖南不同产地芹菜中黄酮含量差别较大,芹菜叶黄酮含量高于芹菜叶柄的黄酮含量。芹菜叶中芹菜素的含量随芹菜种植海拔高度的增加而增加,而芹菜叶柄中芹菜素的含量随芹菜种植海拔高度的增加而减少。3芹菜黄酮类物质提取工艺优化研究在单因素试验基础上,采用正交试验优化了芹菜叶黄酮提取条件（乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间）。芹菜叶黄酮乙醇回流提取最佳条件为:70%乙醇为提取溶剂,1:10（w/v）料液比,提取温度90℃,提取时间120min。同时,测定了湖南不同产地芹菜叶、叶柄的乙醇提取率,结果表明不同产地芹菜乙醇提取率存在差异,这说明湖南不同基因型芹菜内含物含量也存在差异。4芹菜黄酮类化合物的分离纯化与结构鉴定筛选出了XDA-1大孔吸附树脂适用于芹菜黄酮的富集。树脂最佳动态吸附与解吸条件为:2BV/h的流速上样,8BV的水洗体积去杂质,4BV70%的乙醇以2BV/h流速进行洗脱。XDA-1大孔吸附树脂对芹菜黄酮的静态吸附率为88.18%,解吸率为98.43%,芹菜醇提物中黄酮纯度可提高到10.52%,富集倍数可达8.416。经XDA-1树脂富集纯化后的芹菜黄酮,用1.2mol/L的盐酸,在80℃条件下水解2h,乙醚萃取重结晶得到单体化合物Ⅰ,通过UV,IR,¹H NMR,¹³C NMR和MS鉴定为芹菜素（Apigenin,5,7,4′-Trihydroxyflavone）。经高效液相色谱分析纯度达到98.0%。经XDA-1树脂纯化的芹菜粗黄酮利用聚酰胺树脂可进一步纯化。聚酰胺柱层析最优分离条件是:以0.5mL/min的流速上样,3BV的水洗体积洗脱去杂后,再用3BV的40%乙醇水溶液,以1mL/min流速洗脱。芹菜黄酮类物质的含量可达到80%。首次建立了芹菜粗黄酮中芹菜黄酮单体的高速逆流色谱分离法。采用乙酸乙酯:乙醇:乙酸:水（4:1:0.2:5,v/v）两相溶剂体系逆流分离芹菜黄酮,以2mL/min流动相流速,800rpm/min转速,在室温25℃下对芹菜黄酮苷进行分离,芹菜黄酮苷单体在270nm波长检测,HPLC跟踪,芹菜苷（化合物Ⅲ）能得到很好的分离。经液相检测,芹菜黄酮（化合物Ⅲ）纯度为98.27%。将经聚酰胺树脂精制得到的芹菜黄酮采用Sephadex LH-20（1.6cm×80cm）进行柱层析。以50%乙醇恒流洗脱,并用HPLC跟踪监测,分离得到化合物Ⅱ和化合物Ⅲ。通过UV、IR、MS、NMR鉴定为芹菜苷（芹菜素-7-O-葡萄糖-2-O-芹糖苷）、3′-甲氧基-芹菜苷（柯伊利素-7-O-葡萄糖-2-O-芹糖苷）。经高效液相色谱分析（归一法）,纯度分别为98.6%,98.0%。该两个化合物属首次从芹菜叶中分离得到。5芹菜黄酮类物质及单体成分的药理活性评价应用代谢综合症核受体报告基因模型（FXR激活、FXR抑制）、高胆固醇症核受体报告基因模型（LXR）、肝癌细胞株（HepG2）、白血病细胞株（HL-60）为靶点,研究芹菜叶醇提物、芹菜粗黄酮、芹菜素、芹菜苷、3′-甲氧基-芹菜苷的抗高胆固醇、动脉粥样硬化、抑制肝癌细胞增殖、抑制白血病细胞增殖的药理活性。采用MTS法,确定以10μg/mL合适的浓度进行活性筛选,芹菜素、芹菜醇提物在LXR受体上呈现一定的活性,有增加FXR受体敏感性的作用。芹菜醇提物和芹菜素对肝癌细胞（HepG2）和白血病细胞株（HL-60）有一定的抑制作用。芹菜醇提物抑制肝癌细胞（HepG2）和白血病细胞株（HL-60）的GI₅₀值分别为66.07μg/mL和44.07μg/mL,芹菜素抑制肝癌细胞（HepG2）和白血病细胞株（HL-60）的GI₅₀值分别为3.31μg/mL和1.62μg/mL。芹菜黄酮类物质具有治疗代谢综合症的作用,芹菜醇提物和芹菜素都具有抑制肝癌细胞（HepG2）和白血病细胞株（HL-60）的活性,而芹菜黄酮苷对两种癌细胞没有抑制作用。